Меню Рубрики

Гост на определение левомицетина вэжх

ГОСТ 33526-2015 Молоко и продукты переработки молока. Методика определения содержания антибиотиков методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Текст ГОСТ 33526-2015 Молоко и продукты переработки молока. Методика определения содержания антибиотиков методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0—92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2—2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены»

1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным научным учреждением «Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности»

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстандарт)

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны

Сокращенное наименование национального

Минэкономики Республики Армения

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 30 ноября 2015 г. N9 2085-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 33526—2015 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2016 г.

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — е ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано е ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии е сети Интернет

В Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

МОЛОКО И ПРОДУКТЫ ПЕРЕРАБОТКИ МОЛОКА

Методика определения содержания антибиотиков методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Method tor determination ol the antibiotic by high performance liquid chromatography

Настоящий стандарт распространяется на молоко и продукты переработки молока (молоко (сырое. питьевое), сливки (сырые, питьевые), молочные продукты, молокосодержащие продукты, побочные продукты переработки молока, продукцию детского питания на молочной основе, сыр и сырные продукты, масло из коровьего молока и масляную пасту, консервы молочные, мороженое и смеси для мороженого и устанавливает метод высокоэффективной жидкостной хроматографии по определению остаточного содержания антибиотиков: левомицетина (хлорамфеникола), пенициллиновой группы, стрептомицина, тетрациклиновой группы.

Диапазон измерений массовых долей антибиотиков для левомицетина (хлорамфеникола) от 0.0001 млн 1 (мг/кг) до 1.0 млн 1 (мг/кг). для антибиотиков пенициллиновой и тетрациклиновой групп от 0.001 млн 1 (мг/кг) до 1.0 млн 1 (мг/кг). для стрептомицина от 0,005 млн 1 (мг/кг) до 1.0 млн 1 (мг/кг).

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ ИСО 5725-1—2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения 1

ГОСТ ИСО 5725-6—2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике 2

ГОСТ CiML R 76-1—2011 Государственная система обеспечения единства измерений. 8есы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 12.1.004—91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005—88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007—76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019—79 Система стандартов безопасности труда. Электробеэоласностъ. Общие требования и номенклатура видов защиты 3

ГОСТ 12.4.009—83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 12.4.021—75 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования

ГОСТ 245—76 Реактивы. Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-еодный. Технические условия

ГОСТ 908—2004 Кислота лимонная моногидрат пищевая. Технические условия

ГОСТ 1770—74 (ИСО 1042—83. ИСО 4786—80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры. мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

‘ На территорш Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-1—2002. 3 На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-6—2002. 9 На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 12.1.019—2009.

ГОСТ 2603—79 Реактивы. Ацетон. Технические условия ГОСТ 5848—73 Реактивы. Кислота муравьиная. Технические условия ГОСТ 6552—80 Реактивы. Кислота ортофосфорная. Технические условия ГОСТ 6709—72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9147—80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия ГОСТ 10652—73 Реактивы. Соль динатриевая этилендиамик-Ы.Г^М’.М’-тетрауксусной кислоты. 2-еодная (трилон Б). Технические условия

ГОСТ 12026—76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия ГОСТ 25336—82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Тилы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26809.1—2014 Молоко и молочная продукция. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу. Часть 1. Молоко, молочные, молочные составные и молокосодержащие продукты

ГОСТ 26809.2—2014 Молоко и молочная продукция. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу. Часть 2. Масло из коровьего молока, спреды, сыры и сырные продукты, плавленые сыры и плавленые сырные продукты

ГОСТ 29227—91 (ИСО 835-1—81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов на территории государства по соответствующему указателю стандартов, составленному по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

Метод основан на экстракции антибиотиков из пробы продукта, очистке экстракта и определении антибиотиков в экстракте методом высокоэффективной жидкостной хроматографии со спектрофотометрическим детектированием.

4 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда и реактивы

Хроматограф для проведения ВЭЖХ. включающий следующие элементы:

— колонка хроматографическая обращенно-фазная (250 4.6) мм. заполненная силикагелем с диаметром частиц сорбента 3 мкм;

— детектор спектрофотометрический или диодно-матричный с длиной волны детектирования 265 нм и 280 нм с погрешностью задания длины волны 11 нм;

— петлевое устройство для ввода пробы с рабочим объемом петли 0.020 см э ;

— регистрирующее устройство, позволяющее проводить измерения площади (или высоты) пика с погрешностью ± 1 %;

— программное обеспечение для статистической обработки полученных результатов измерений. Устройство вакуумное для твердофазной экстракции.

Картридж для твердофазной экстракции объемом не более 6 см 3 , заполненный обращенно-фазным сорбентом с диаметром частиц не более 50 мкм.

Весы неавтоматического действия по ГОСТ OIML R 76-1 или весы по нормативным документам, действующим на территории государств, принявших стандарт, с пределом допускаемой абсолютной погрешности ± 0.5 мг и ± 1.0 мг.

Анализатор потенциометрический (pH-метр) с диапазоном измерения 1-14 ед. pH, с пределом допускаемой абсолютной погрешности ± 0.01 ед. pH.

Центрифуга лабораторная с охлаждением, обеспечивающая скорость вращения не менее 15000 об/мин и диапазон температур охлаждения от 4 в С до 20 в С. с адаптерами для пробирок вместимостью 15 см 3 и микроцентрифужных пробирок вместимостью 1.5 см 3 .

Модуль термостатируемый нагревательный с системой отдувки растворителей инертным газом и максимальной температурой термостатироаания 40 в С.

Баня водяная термостатируемая.

Баня ультразвуковая с рабочей частотой не менее 20 Гц и объемом не менее 1 дм 3 .

Гомогенизатор роторный с четырехлопастным ножом, с угловой скоростью вращения ножей (1000 — 10000) мин 1 . включающий емкость вместимостью 1.0 дм 3 .

Встряхиватель лабораторный (вортекс) вибрационный для пробирок орбитального типа движения с амплитудой вращения гнезда 3 мм и скоростью вращения гнезда (150 — 2500) мин \

Дозаторы механические переменного объема (0.1-3 мм 3 . 0,5-10 мм 3 . 20-200) мм 3 . 100-1000 мм 3 . 1-5 см 3 ) с наконечниками.

Колбы мерные 2-50-2,2-100-2. 2-1000-2 по ГОСТ 1770.

Пипетки М-1-5, 1-1-1-10 по ГОСТ 29227.

Пробирки мерные стеклянные П-1-10-0.1 ХС по ГОСТ 1770.

Цилиндр 1-25-1. 1-100-1. 1-250-2 лоГОСТ 1770.

Виалы (флаконы полипропиленовые) вместимостью 15 см 3 и 50 см 3 с герметично закрывающимися пластмассовыми крышками.

Колба Кн-1-250-24/29, Кн-1-500-24/29 ТС по ГОСТ 25336.

Стакан В-1-100. В-1-500. В-1-1000 ТС по ГОСТ 25336.

Воронка В-56 50 ХС по ГОСТ 25336.

Ступка фарфоровая с пестиком по ГОСТ 9147.

Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.

Фильтр нейлоновый с размером пор 0.45 мкм.

Бекзилпенициллин. массовой долей основного вещества не менее 99 %.

Демеклоциклин. массовой долей основного вещества не менее 90 %.

Доксициклин, массовой долей основного вещества не менее 90 %.

Кислота лимонная моногидрат пищевая по ГОСТ 908.

Кислота муравьиная по ГОСТ 5548. ч.д.а.

Кислота ортофосфорная по ГОСТ 6552. х.ч.

Метанол для хроматографии (метиловый спирт), х.ч.

Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-еодный по ГОСТ 245. ч.д.а.

Окситетрациклина гидрохлорид, массовой долей основного вещества не менее 90 %.

Соль динатриевая этилвндиамин-М.М.М.Ы’-тетраухсУсной кислоты 2-водная (трилон Б) по ГОСТ 10652. х.ч.

Стрептомицина сульфат, массовой долей основного вещества не менее 96 %.

Тетрациклина гидрохлорид, массовой долей основного вещества не менее 90 %. Хлорамфеникол (левомицетин), массовой долей основного вещества не менее 99 %. Хлортетрациклин гидрохлорид, массовой долей основного вещества не менее 90 %. Феноксиметилпенициллин. массовой долей основного вещества не менее 99 %.

Вода для лабораторного анализа деионизированная, с удельным сопротивлением 28 Ом. степень чистоты 2 по ISO 3696.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Допускается применение других средств измерения, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающим необходимую точность измерения, а также реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.

Отбор проб — по ГОСТ 26809.1, ГОСТ 26809.2, а также другим нормативным документам, действующим на территории государств, принявших стандарт.

Если определение не может быть проведено сразу после отбора проб, их хранят в холодильнике при температуре (4 ± 2) ®С не более 48 ч.

6 Подготовка к проведению измерений

6.1 Приготовление растворов

6.1.1 Приготовление раствора лимонной кислоты молярной концентрации с (С6Нв7 Н20)* 0,1 моль/дм 3

В мерную колбу вместимостью 1000 см 3 помещают (21,000 ± 0.001) г лимонной кислоты, растворяют в небольшом количестве деионизированной воды и тщательно перемешивают. Объем раствора доводят деионизированной водой до метки.

Раствор хранят при температуре (20 ± 2) *С не более 1 мес.

6.1.2 Приготовление раствора натрия фосфорнокислого молярной концентрации с (ЫаНгРО* 2НгО) * 0,2 моль/дм 3

В мерную колбу вместимостью 1000 см 3 вносят (35.600 ± 0.001) г натрия фосфорнокислого, растворяют в небольшом количестве деионизированной воды и тщательно перемешивают. Объем раствора доводят деионизированной водой до метки.

Раствор хранят при температуре (20 ± 2) *С не более 1 мес.

6.1.3 Приготовление буферного раствора

В конической колбе вместимостью 250 см 3 смешивают 60 см 3 раствора лимонной кислоты молярной концентрации 0.1 моль/дм 3 (6.1.1) и 40 см 3 раствора натрия фосфорнокислого молярной концентрации 0.2 моль/дм 3 (6.1.2). добавляют (37.200 ± 0,001) г трилона Б. аккуратно перемешивают и измеряют значение pH полученного раствора. Значение pH должно составлять 4,0. При необходимости значение pH доводят до 4.0 ед.рН ортофосфорной кислотой.

Раствор хранят при температуре (20 ± 2) *С не более 1 мес.

6.1.4 Приготовление растворов элюентов мобильной фазы А и Б

6.1.4.1 Для приготовления раствора элюента мобильной фазы А в мерную колбу вместимостью 1000 см 3 помещают 200 см 3 деионизированной воды, добавляют 5 см 3 муравьиной кислоты и тщательно перемешивают. Объем раствора доводят деионизированной водой до метки, фильтруют через нейлоновый фильтр.

Раствор хранят при температуре (2012) °С не более 1 мес.

6.1.4.2 Для приготовления раствора элюента мобильной фазы Б в мерную колбу вместимостью 1000 см 3 помещают 200 см 3 метанола, добавляют 5 см 3 муравьиной кислоты и тщательно перемешивают. Объем раствора доводят метанолом до метки, фильтруют через нейлоновый фильтр.

Раствор хранят при температуре (20 ± 2) *С не более 1 мес.

6.1.5 Приготовление 50 %-ного раствора метанола

В мерную колбу вместимостью 50 см 3 помещают 25,0 см 3 метанола, добавляют небольшое количество деионизированной воды и тщательно перемешивают. Объем раствора доводят деионизированной водой до метки. Колбу помещают на ультразвуковую баню на 5 мин.

Срок хранения раствора в темной посуде при температуре (4 ± 2) *С — не более 1 мес.

6.1.6 Приготовление градуировочных растворов

6.1.6.1 Приготовление основных градуировочных растворов

6.1.6.1.1 В мерную пробирку вместимостью 10 см 3 помещают по 10 мг доксициклина. окситетра-циклина гидрохлорида, тетрациклина гидрохлорида и хпортетрациклина гидрохлорида, взвешенных с точностью до 0.5 мг. Добавляют 5 см 3 метанола и помещают в ультразвуковую баню на 1 мин. Объем полученного раствора доводят метанолом до метки.

6.1.6.1.2 В мерную пробирку вместимостью 10 см 3 помещают 10 мг стрептомицина сульфата, взвешенного с точностью до 0,5 мг. Добавляют 5 см 3 метанола и помещают в ультразвуковую баню на 1 мин. Объем полученного раствора доводят метанолом до метки.

6.1.6.1.3 В мерную пробирку вместимостью 10 см 3 помещают 10 мг хлорамфеникола (левоми-цитина). взвешенного с точностью до 0.5 мг. Добавляют 5 см 3 метанола и помещают в ультразвуковую баню на 1 мин. Объем полученного раствора доводят метанолом до метки.

6.1.6.1.4 8 мерную пробирку вместимостью 10 см 3 помещают по 10 мг феноксиметилпекицил-лина. бензилпенициллина. взвешенных с точностью до 0.5 мг. Добавляют 5 см 3 метанола и помещают в ультразвуковую баню на 1 мин. Объем полученного раствора доводят метанолом до метки.

6.1.6.1.5 Массовая концентрация каждого антибиотика в растворах по 6.1.6.1.1 — 6.1.6.1.4 составляет 1 мг/см 3 (или 1000 мг/дм 3 ).

Уточненное значение концентрации антибиотика рассчитывается с учетом содержания основного вещества.

6.1.6.1.6 Раствор антибиотика массовой концентрации 0.1 мг/см 3 (или 100 мг/дм 3 ) готовят из раствора антибиотика массовой концентрации 1 мг/см 3 (6.1.6.1.5) путем его разведения метанолом в 10 раз.

Растворы хранят при температуре минус (20 ± 2) «С не более 3 мес.

Перед применением раствор выдерживают при комнатной температуре в темном месте не менее 20 мин. но не более 2 ч.

6.1.6.2 Приготовление градуировочных образцов

Для построения градуировочного графика готовят серию градуировочных образцов в количестве не менее пяти с массовыми концентрациями антибиотиков в диапазоне от 0.001 мг/дм 3 до 1 мг/дм 3 (для левомицетина в диапазоне от 0,00015 мг/дм 3 до 0,1 мг/дм 3 ) путем разбавления метанолом основных градуировочных растворов антибиотиков, приготовленных по 6.1.6.1.

6.1.6.3 Приготовление раствора внутреннего стандарта демеклоциклина

В мерную пробирку вместимостью 10 см 3 помещают 10 мг демеклоциклина. взвешенного с точностью до 0.5 мг. Добавляют 5 см 3 метанола и помещают в ультразвуковую баню на 1 мин. Объем полученного раствора доводят метанолом до метки.

Массовая концентрация раствора внутреннего стандарта демеклоциклина в растворе составляет 1 мг/см 3 (уточненное значение концентрации внутреннего стандарта рассчитывается с учетом содержания основного вещества).

Путем нескольких разбавлений доводят массовую концентрацию раствора внутреннего стандарта демеклоциклина до значения 1 мкг/см 3 . Раствор с данной концентрацией используют для внесения в исследуемые образцы.

Раствор хранят при температуре минус (20 ± 2) *С не более 3 мес.

Перед применением раствор выдерживают при комнатной температуре в темном месте не менее 20 мин.

6.2 Подготовка хроматографической системы

6.2.1 Включают хроматограф. Подготовку хроматографа к работе осуществляют в соответствии с Руководством по эксплуатации прибора.

6.2.2 Устанавливают следующие условия хроматографирования:

— скорость потока элюента — 0.1 см 3 /мин;

— объем вводимой пробы — 20 мм 3 :

— температура хроматографирования — (30 ± 1) в С;

— длина волны детектирования 280 нм.

Разделение проводят в режиме градиентного элюирования: с 0 % до 55 % мобильной фазы Б (6.1.4.2) за 25 мин.

Читайте также:  Смесь альбуцид с левомицетином

6.2.3 Перед каждым измерением для оценки работы хроматографа проводят контрольное измерение. вводя в хроматограф образец с известным значением содержания антибиотика. В качестве такого образца может служить раствор антибиотика, приготовленный из реактива антибиотика с известным содержанием антибиотика.

6.3 Построение градуировочной характеристики

6.3.1 Для построения градуировочной зависимости анализируют серию градуировочных образцов. приготовленных по 6.1.6.2. в условиях, описанных в 6.2 и 7.

6.3.2 Используя программное обеспечение, прилагаемое к хроматографу, строят график зависимости массовой концентрации антибиотика от отношения площади хроматографического пика антибиотика к площади пика внутреннего стандарта.

Градуировочная характеристика считается приемлемой, если рассчитанное значение квадрата коэффициента корреляции для градуировочной характеристики каждого антибиотика составит не менее 0.98.

6.3.3 Градуировку проводят не реже одного раза в месяц, а также при изменении условий хроматографического анализа, при смене колонки, при замене реактивов или несоответствии результатов метрологическим требованиям.

6.4 Подготовка проб продуктов

6.4.1 Пробы молока и жидкой молочной продукции перемешивают путем перевертывания емкости с пробами не менее трех раз.

Пробы продуктов освобождают от упаковки, нагревают до температуры (20 ± 2) °С. аккуратно перемешивают и сразу же проводят измерение.

6.4.2 Пробы продуктов, содержащие ароматизаторы, пищевкусовые добавки (кофе, какао, фруктово ягодный или овощной наполнитель и т.д.), образующие с продуктом однородную структуру, а также неотделяемые пищевкусовые компоненты (например, кокосовую стружку), полностью освобождают от упаковки (при наличии), помещают в лабораторный стакан вместимостью 500-1000 см 3 и нагревают на водяной бане до температуры (32 ± 2) *С. после чего полностью переносят в стакан гомогенизатора и гомогенизируют в течение 1-3 мин при частоте вращения ножей от 2000 об/мин до 5000 об/мин до получения однородной массы. Затем пробу переносят в колбу вместимостью 500 см 3 с притертой пробкой и охлаждают до температуры (2012) *С. Пробу для анализа отбирают сразу же после гомогенизации во избежание ее расслоения.

6.4.3 Пробы творога, творожных продуктов и творожных полуфабрикатов нагревают до температуры (20 ± 2) °С. растирают а фарфоровой ступке до получения однородной консистенции и пере* носят в колбу вместимостью 500 см 3 с притертой пробкой.

6.4.4 Пробы сухих молочных продуктов растирают в ступке, тщательно перемешивая.

6.4.5 Пробы мороженого освобождают от глазури и вафель, оставляют при комнатной темпера* туре для отепления. Затем отделяют фрукты, орехи, изюм и другие отделяемые компоненты. При подготовке мороженого с наполнителями, обладающими текучестью (мягкая карамель, сироп, крем-брюле и т.д.), полностью растаявшее мороженое переносят в стакан гомогенизатора вместимостью от 500 см 3 до 1000 см 3 и гомогенизируют в течение 1-3 мин при частоте вращения ножей от 1000 об/мин до 5000 об/мин до получения однородной массы. Затем пробу переносят в колбу вместимостью 500 см 3 с притертой пробкой и охлаждают до температуры (20 ± 2) *С. Пробу для анализа отбирают сразу же после гомогенизации во избежание ее расслоения.

6.4.6 Пробу сыра и сырного продукта измельчают на металлической терке с мелкой перфорацией и аккуратно перемешивают в ступке.

6.4.7 Пробу масла, масляной пасты помещают в стакан вместимостью 100 см 3 , расплавляют на водяной бане при температуре (60 ± 2) *С и перемешивают до получения однородной эмульсии.

6.4.8 Подготовка проб продуктов для хроматографирования

6.4.8.1 В стакан вместимостью 100 см 3 помещают (5.000 ± 0.001) г продукта, подготовленного по

6.4.2 — 6.4.6. Добавляют 20 см 3 раствора элюекта мобильной фазы А (6.1.4.1) и аккуратно перемешивают Полученный раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 см 3 . ополаскивая стакан раствором элюекта мобильной фазы А (6.1.4.1). Объем раствора доводят раствором элюента мобильной фазы А (6.1.4.1) до метки.

Затем колбы с раствором помещают в ультразвуковую баню на 15 мин. охлаждают до температуры (20 ± 2) *С. Полученную смесь фильтруют через бумажный фильтр. В случае получения непрозрачного раствора допускается его центрифугирование при скорости вращения 15000 об/мин в течение 5 мин.

6.4.8.2 В мерную колбу вместимостью 50 см 3 помещают (5,000 ± 0.001) г масла, пасты масляной, подготовленных по 6.4.7. и добавляют 35 см 3 раствора элюента мобильной фазы А (6.1.4.1). Колбу помещают в ультразвуковую баню на 15 мин. охлаждают до температуры (20 1 2) *С. Объем раствора доводят раствором элюента мобильной фазы А (6.1.4.1) до метки. Полученную смесь центрифугируют при скорости вращения 15000 об/мин в течение 5 мин. Для анализа используем водную фракцию.

6.5 Подготовка проб для определения антибиотиков тетрациклиновой группы

В полипропиленовый флакон (виалу) вместимостью 15 см 3 помещают (1.000 ± 0,001) г пробы продукта, подготовленной по 6.4.1, или 10.0 см 3 пробы продукта, подготовленной по 6.4.8, добавляют 0.1 см 3 раствора внутреннего стандарта (6.1.6.3). Затем добавляют 3 см 3 ацетонитрила, закрывают крышкой и интенсивно перемешивают на встряхивателе в течение 3 мин. Оставляют на 15 мин в горизонтальном положении. Далее виалу с образцом помещают в центрифугу, предварительно охлажденную до температуры 4 °С. и центрифугируют при скорости вращения 4000 об/мин в течение 20 мин.

Полученную водную фракцию переносят в мерную пробирку вместимостью 10 см 3 и упаривают до 1 см 3 на нагревательном модуле в токе азота под вакуумом при температуре (40 ± 1) *С. К полученному остатку добавляют 3-5 см 3 буферного раствора (6.1.3). аккуратно перемешивают. Объем раствора доводят буферным раствором (6.1.3) до метки и помещают в ультразвуковую баню на 1 мин.

6.6 Подготовка проб для определения левомицетина, стрептомицина и антибиотиков пенициллиновой группы

В полипропиленовый флакон (виалу) вместимостью 15 см 3 помещают (1.000 ± 0,001) г пробы продукта, подготовленной по 6.4.1. или 10.0 см 3 пробы продукта, подготовленной по 6.4.8. Затем добавляют 3 см 3 ацетонитрила, закрывают крышкой и интенсивно перемешивают на встряхивателе в течение 3 мин. Оставляют на 15 мин в горизонтальном положении. Далее виалу с образцом помещают в центрифугу, предварительно охлажденную до температуры 4 *С. и центрифугируют при скорости вращения 4000 об/мин в течение 20 мин.

Полученную водную фракцию переносят в мерную пробирку вместимостью 10 см 3 и упаривают до 1 см 3 на нагревательном модуле в токе азота под вакуумом при температуре (40 ± 1) *С. К полученному остатку добавляют 3-5 см 3 буферного раствора (6.1.3). аккуратно перемешивают. Объем раствора доводят буферным раствором (6.1.3) до метки и помещают в ультразвуковую баню на 1 мин.

6.7 Проведение твердофазной экстракции

Для проведения твердофазной экстракции картридж для ТФЭ предварительно кондиционируют 6 см 3 50 %-ного раствора метанола и уравновешивают 6 см 3 деионизированной воды. Затем вносят пробу продукта, подготовленную по 6.5 или 6.6, и вновь промывают 6 см 3 деионизированной воды. Антибиотики элюируют с сорбента при помощи 6 см 3 раствора элюента мобильной фазы Б (6.1.4.2). Полученный элюат упаривают на нагревательном модуле досуха в токе азота под вакуумом при тем* пературе (40 ± 1) *С, затем растворяют раствором элюента мобильной фазы Б (6.1.4.2) до 0.5 см 3 , после чего используют для хроматографирования.

7 Условия проведения измерений

При выполнении измерений в лаборатории должны соблюдаться следующие условия:

— температура окружающего воздуха. (20 ± 5) в С;

— относительная влажность воздуха . (55 ± 25) %;

-атмосферное давление. (96 ±10) кПа;

— частота переменного тока. (50 ± 5) Гц:

— напряжение в сети . (220 ± 10) В.

8.1 Хроматографирование градуировочных растворов и анализируемой пробы продукта проводят в идентичных условиях.

8.2 Проводят два последовательных измерения. Подготовленную по 6.7 пробу вводят в колонку хроматографа и проводят хроматографический анализ в условиях, указанных в 6.2.2.

Если содержание антибиотиков в анализируемой пробе превышает значение максимального градуировочного уровня, то анализируемую пробу разводят в 10 или более раз мобильной фазой А и проводят повторные измерения.

9 Обработка результатов измерений

9.1 Обработка результатов измерений содержания антибиотиков тетрацикликовой группы, полученных с применением внутреннего стандарта

Определение содержания антибиотиков тетрациклиновой группы выполняют с помощью программного обеспечения, прилагаемого к хроматографу. С помощью программы обработки спектров вычисляют отношение площади пика определяемого антибиотика к площади пика внутреннего стандарта. Затем, используя программу обработки данных, рассчитывают содержание соответствующего антибиотика в подготовленной пробе.

9.2 Обработка результатов измерений содержания антибиотиков пенициллиновой группы, левомицетина (хлорамфеникола) и стрептомицина

Определение содержания антибиотиков выполняют с помощью программного обеспечения, прилагаемого к хроматографу. Используя градуировочный график, рассчитывают значение массовой концентрации соответствующего антибиотика в подготовленной пробе.

9.3 Массу пробы продукта, взятую для разведения, т, г. вычисляют по формуле

где т, — масса пробы продукта, подготовленная по 6.4.2 — 6.4.7, взятая для анализа и отобранная по 6.4.9. П

Иг — объем пробы, подготовленный по 6.4.8 и взятый для анализа (6.5 — 6.6). см 3 .

V, — общий объем растаора. полученный при разведении пробы продукта согласно 6.4.8. см 3 , (У, =50 см 3 ).

9.4 Массовую долю антибиотика в продукте X. млн 1 (мг/кг). вычисляют по формуле

где С — массовая концентрация антибиотика, найденная по градуировочному графику, мг/дм 3 :

Уз — объем элюата после выпаривания по 6.7. см 3 ;

т — масса пробы продукта, подготовленная по 6.4.1 и отобранная для анализа (6.S-6.6) или определенная по формуле (1). г.

За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение результатов двух по* следовательных измерений, выполненных в условиях повторяемости (ГОСТ ИСО 5725-1. пункт 3.14), если соблюдается условие приемлемости по 10.1.

9.5 Контроль точности результатов измерений

Приписанные характеристики погрешности и ее составляющих метода определения содержания антибиотиков в молоке и продуктах переработки молока при Р = 0.95 приведены в таблице 1.

Диапазон измерений массовой доли антибиотиков, млн 1 (мг/кг)

источник

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ЛЕВОМИЦЕТИНА (ХЛОРАМФЕНИКОЛА, ХЛОРМИЦЕТИНА) В ПРОДУКТАХ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ И ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУК 4.1.1912-04 (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 06.03.2004)

Утверждаю
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации,
Первый заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
6 марта 2004 года
Дата введения —
1 мая 2004 года
4.3. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ЛЕВОМИЦЕТИНА
(ХЛОРАМФЕНИКОЛА, ХЛОРМИЦЕТИНА) В ПРОДУКТАХ ЖИВОТНОГО
ПРОИСХОЖДЕНИЯ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ
ХРОМАТОГРАФИИ И ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.1.1912-04
1. Разработаны: ГУ НИИ питания РАМН (В.А. Тутельян, С.А. Хотимченко, С.А. Шевелева, В.К. Кирничная, Т.В. Киселева, Н.Г. Орлова, Н.Р. Ефимочкина, Н.В. Барбер), Московским государственным университетом им. М.В. Ломоносова (А.М. Егоров, А.Ю. Колосова, Ж.В. Самсонова).
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Минздрава России.
3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г. Онищенко 6 марта 2004 г.
4. Введены в действие 1 мая 2004 г.
5. Введены впервые.
1. Назначение и область применения
Настоящие Методические указания предназначены для учреждений госсанэпидслужбы Минздрава РФ и других ведомств, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов в соответствии с СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов».
Методические указания распространяются на методы с различным целевым назначением (арбитраж, скрининг). Два метода определения остаточных количеств левомицетина (хлорамфеникола, хлормицетина) в продуктах животного происхождения:
I — высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ);
II — иммуноферментного анализа (ИФА).
2. Общие положения
Среди ряда веществ, которые могут контаминировать продовольственное сырье и пищевые продукты, важное место занимают ветеринарные препараты, используемые как для лечения животных, так и в качестве стимуляторов роста. Сильнодействующими лекарственными препаратами, используемыми в ветеринарии, остаются антибиотики. Известно большое число антибиотиков, обладающих различными свойствами, механизмом и спектром действия, распределением в организме животных, характером метаболизма и т.д.
Систематическое поступление в организм человека антибиотиков с продуктами питания крайне вредно, поскольку они могут оказывать нежелательные эффекты, чаще всего в виде возникновения аллергических реакций, дисбактериозов, подавлять активность некоторых ферментов, изменять микрофлору кишечника, способствовать распространению устойчивых форм микроорганизмов и т.д. Следует учитывать возможность отрицательного влияния антибиотиков в сырье для пищевой промышленности на проведение ряда технологических процессов в переработке мяса, рыбы, молока (в частности, при получении кисломолочных продуктов) и других продуктов. Кроме того, наличие антибиотиков может затруднять бактериологические исследования качества продуктов животного происхождения.
Хлорамфеникол (далее — ХАФ) является антибиотиком широкого спектра действия, обладающим высокой активностью в отношении бактерий и риккетсий. В отличие от многих антибиотиков ХАФ обладает довольно простым химическим строением.
Хлорамфеникол малорастворим в воде, но хорошо в спирте. Установлено, что ХАФ медленно выводится из организма животных и сравнительно долго сохраняет свою активность при хранении продуктов.
В настоящее время для определения ХАФ в продуктах питания применяют ряд методов, в их числе микробиологические методы, которые являются сравнительно простыми и дешевыми, однако отличаются недостаточной специфичностью и воспроизводимостью результатов.
Для арбитражных исследований вводятся хроматографические методы, в частности ВЭЖХ, позволяющий раздельно определять как ХАФ, так и его метаболиты.
Количественный метод определения ХАФ при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии в сельскохозяйственных продуктах отличается низким пределом обнаружения (0,01 мг/кг), хорошей воспроизводимостью (относительное стандартное отклонение 0,15 — 0,21) и надежностью.
Для скрининговых целей в мире широко применяют методы иммунохимического анализа, обеспечивающие высокую чувствительность, специфичность и точность. Для контроля пищевой продукции предпочтение отдается методам твердофазного иммуноферментного анализа, которые являются высокочувствительными (предел обнаружения — 0,00008 мг/кг).
Методические указания предназначены для учреждений госсанэпидслужбы Минздрава РФ и других ведомств, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов. Согласно СанПиН 2.3.2.1078-01 содержание левомицетина в продуктах животного происхождения не допускается.
3. Отбор и подготовка проб
Отбор и подготовка проб аналогичны для обоих методов исследования.
Отбор продуктов питания осуществляется в соответствии с требованиями ГОСТов на исследуемые продукты: ГОСТ 7269-79 «Мясо», ГОСТ 7202.0-74 «Мясо птицы», ГОСТ 3622-68 «Молоко и молочные продукты».
Отобранные образцы продуктов герметично упаковывают в полиэтиленовые мешки, стеклянные банки с притертыми крышками или укладывают в коробки. Образцы доставляют в лабораторию для анализа сразу же после отбора проб или, в случае необходимости, хранят на холоде, а для скоропортящихся продуктов осуществляют замораживание -4 — -10 °С, используя для этой цели холодильники или соответствующие приспособления.
К исследованию скоропортящихся образцов следует приступать в день их доставки в лабораторию. При отсутствии такой возможности образцы должны хранить при указанной выше температуре не более двух недель со времени отбора среднего образца.
4. Определение остаточных количеств
левомицетина (хлорамфеникола, хлормицетина)
в продуктах животного происхождения методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии
4.1. Принцип метода
Метод основан на извлечении хлорамфеникола экстракцией этилацетатом, последовательной промывке экстракта разбавленным раствором щелочи и кислоты, обезжиривании петролейным эфиром и хроматографическом разделении с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии в обращенно-фазном варианте.
4.2. Аппаратура, материалы, реактивы
Жидкостный хроматограф с УФ детектором,
длина волны 278 нм, любой марки
Колонка с обращенной фазой (ODS, С18) длина
25 см, диаметр 4,6 мм, диаметр сорбента 5 мкм
Гомогенизатор тканей ГОСТ 15906
Центрифуга настольная
или аналогичная ТУ 5.375-4261
Ротационный испаритель с ловушкой ТУ 25-11-917
Азот, поверочный нулевой газ ГОСТ 9293-74
Весы технические ГОСТ 19491
Весы аналитические ГОСТ 24104-88Е
Цилиндры мерные, объемом 50 и 100 куб. см ГОСТ 1770
Колбы плоскодонные на 50 и 100 куб. см
НШ N 14,5 ТУ 48-52
Колбы мерные на 25, 50 и 100 куб. см ГОСТ 1770
Пипетки 1,0, 2,0, 5 и 10 куб. см ГОСТ 29227-91
Колбы для упаривания с круглым или
коническим дном на 50 и 100 куб. см с НШ
N 14,5 ГОСТ 10394
Воронка делительная на 100 куб. см ГОСТ 2536
Натрий серно-кислый, безводный ГОСТ 4166
Этилацетат, хч ГОСТ 5.1070
Натрий хлористый, насыщенный раствор в воде ГОСТ 4233
Гидроокись натрия, хч
10%-ный раствор щелочи (NaOH, КОН)
Уксусная кислота ГОСТ 61-75
10%-ный раствор уксусной кислоты
Серная кислота ГОСТ 14262-78
Калий фосфорно-кислый однозамещенный
0,025 М раствор КН РО ТУ 6-09-5324-87
2 4
Ацетонитрил ТУ 6-09-3534
Петролейный эфир, фракция 40 — 70 °С
Метанол (спирт метиловый)
Дециламин, импорт. ГОСТ 6995-77
Вода дистиллированная ГОСТ 6709
Левомицетина сукцинат растворимый
4.3. Требования техники безопасности
при проведении испытаний
Помещение, в котором проводится определение хлорамфеникола, должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Все операции анализа необходимо проводить в вытяжном шкафу с использованием индивидуальных средств защиты.
4.4. Подготовка к испытанию
4.4.1. Приготовление растворов
Взвешивают 25 мг левомицетина, помещают в мерную колбу на 25 куб. см и растворяют в метаноле, концентрация левомицетина 1 мг/мл. В мерную колбу на 25 куб. см помещают 0,25 куб. см полученного раствора и разбавляют метанолом до метки. Концентрация левомицетина в стандартном растворе 10 нг/мкл.
4.5. Проведение испытания методом ВЭЖХ
4.5.1. Подготовка образца для определения левомицетина в
молоке
Смешивают 25 куб. см молока с 12 г безводного сульфата натрия
и экстрагируют (3 раза по 15 куб. см этилацетата). Полученную
смесь центрифугируют 15 мин. со скоростью 4000 об./мин. и
декантируют. Этилацетатный слой промывают последовательно 5 куб.
см насыщенного раствора NaCl с добавлением в него 0,2 куб. см 10%
NaOH; 5 куб. см насыщенного раствора NaCl с добавлением 0,2 куб.
см 10% СН СООН; 5 куб. см насыщенного раствора NaCl. Органический
3
слой отбирают и упаривают на ротационном испарителе (при 50 °С) до
возможно минимального объема, отдувают азотом до исчезновения
запаха органических растворителей, добавляют 3 куб. см смеси
ацетонитрил-вода (1:4) и экстрагируют 3 раза по 5 куб. см
петролейным эфиром. Петролейный эфир отбрасывают и извлекают
левомицетин экстракцией этилацетатом (3 раза по 5 куб. см).
Этилацетатный слой упаривают досуха, растворяют в 0,1 куб. см
метанола.
4.5.2. Подготовка образца для определения левомицетина в мясе
Гомогенизируют 10 г мяса с 15 куб. см фосфатного буфера (0,025
М КН РО + 0,025 М Na HPO ) рН = 6,88 и экстрагируют 3 раза по 30
2 4 2 4
куб. см этилацетата. Полученную взвесь центрифугируют 15 мин. при
4000 об./мин. и декантируют этилацетатный слой, промывают
последовательно 5 куб. см насыщенного раствора NaCl с добавлением
0,2 мл 10%-ного NaOH; 5 мл насыщенного раствора NaCl с добавлением
0,2 мл 10%-ного СН СООН и 5 куб. см насыщенного раствора NaCl.
3
Органический слой отбирают и упаривают на ротационном испарителе
(при 50 °С) до возможно минимального объема, отдувают азотом до
исчезновения запаха органических растворителей, добавляют 3 куб.
см смеси ацетонитрил-вода (1:4) и экстрагируют 3 раза по 5 куб. см
петролейного эфира, петролейный эфир отбрасывают и извлекают
левомицетин экстракцией этилацетатом (3 раза по 5 куб. см).
Этилацетатный слой упаривают досуха, растворяют в 0,1 куб. см
метанола.
4.5.3. Подготовка образца для определения левомицетина в яйцах
Перетирают 10 г гомогената яйца с 5 г Na SO , приливают 40
2 4
куб. см этилацетата и 5 куб. см 1Н H SO , перемешивают и
2 4
центрифугируют 5 — 10 мин. при 4000 об./мин., этилацетатный слой
декантируют, водную часть экстрагируют последовательно 30 и 20
куб. см этилацетата, при необходимости применяя центрифугирование
для расслоения. Объединенные этилацетатные слои промывают
последовательно 10 куб. см 2-процентного раствора Na CO
2 3
насыщенного NaCl; 10 куб. см насыщенного раствором NaCl.
4.6. Условия хроматографирования (ВЭЖХ)
В жидкостной хроматограф с колонкой (Ультрасфер ODS, С ) 5
18
мкм (250 х 4,6 мм), УФ детектором при лямбда = 278 нм, используя
элюент ацетонитрил-вода-дециламин (40:60:0,1), вводят 5 мкл
стандартного раствора (10 нг/мкл) левомицетина. В тех же условиях
вводят метанольный экстракт образца (молока, мяса, яиц).
4.7. Подтверждение наличия левомицетина в образцах
Для подтверждения наличия левомицетина к 50 мкл метанольного экстракта приливают 50 мкл 10%-ного раствора КОН и нагревают 20 мин. при 70 °С, 10 мкл полученного раствора вводят в тех же условиях в колонку жидкостного хроматографа. На полученной хроматограмме пик с временем удерживания левомицетина отсутствует. Это подтверждает наличие левомицетина в образце.
4.8. Обработка результатов
4.8.1. За окончательный результат измерения принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. Окончательный результат округляют до второго десятичного знака.
Таблица 1
МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ
ХЛОРАМФЕНИКОЛА В ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
(МОЛОКЕ, МЯСЕ, ЯЙЦАХ)
—————————————T—————————¬
¦ Статистический параметр ¦Соединение — хлорамфеникол¦
+————————————-+—————————+
¦Нижний предел определения, мг/кг ¦0,01 ¦
+————————————-+—————————+
¦Интервал надежного определения, мг/кг¦0,01 — 10,0 ¦
+————————————-+—————————+
¦Среднее значение открываемости ¦95,5 ¦
¦(показатель правильности), % ¦ ¦
+————————————-+—————————+
¦Допустимое расхождение между резуль- ¦7,0 ¦
¦татами двух параллельных определений ¦ ¦
¦хлорамфеникола, полученными в одной ¦ ¦
¦лаборатории в одной серии измерений

Читайте также:  Смекта и левомицетин совместимость

источник

научная статья по теме ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ЛЕВОМИЦЕТИНА (ХЛОРАМФЕНИКОЛА) В КОРОВЬЕМ МОЛОКЕ МЕТОДОМ ОБРАЩЕННО-ФАЗОВОЙ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ Химия

Авторы работы:

Научный журнал:

Текст научной статьи на тему «ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ЛЕВОМИЦЕТИНА (ХЛОРАМФЕНИКОЛА) В КОРОВЬЕМ МОЛОКЕ МЕТОДОМ ОБРАЩЕННО-ФАЗОВОЙ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ»

ЖУРНАЛ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2013, том 68, № 2, с. 203-207

ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ЛЕВОМИЦЕТИНА (ХЛОРАМФЕНИКОЛА) В КОРОВЬЕМ МОЛОКЕ МЕТОДОМ ОБРАЩЕННО-ФАЗОВОЙ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

© 2013 г. В. Ю. Орлов, А. С. Лебедев

Ярославский государственный университет им. П.Г. Демидова, факультет биологии и экологии

150000Ярославль, пр-д Матросова, 9 Поступила в редакцию 27.02.2012 г., после доработки 05.07.2012 г.

Разработана чувствительная, селективная, точная и надежная методика определения остаточных количеств левомицетина (хлорамфеникола) в сыром и пастеризованном коровьем молоке, включающая фильтрование образца, очистку образца твердофазной экстракцией, очистку элюата жидкостной экстракцией, концентрирование упариванием под вакуумом и определение обращенно-фазовой ВЭЖХ с детектированием при 278 нм. Подвижная фаза — смесь (15 : 85, по объему) ацетонитрила и воды, содержащей 1 об. % пропанола-2. Предел обнаружения 0.45 мкг/кг, предел количественного определения 1.40 мкг/кг, предел повторяемости 6.93%.

Ключевые слова: левомицетин, хлорамфеникол, обращенно-фазовая ВЭЖХ, пастеризованное коровье молоко, сырое коровье молоко.

Левомицетин — антибиотик, активный в отношении как грамположительных, так и грамотри-цательных бактерий и некоторых вирусов [1, 2]. Жесткий контроль содержания левомицетина в пищевых продуктах обусловлен широким спектром побочных воздействий на организм человека. Систематическое поступление этого антибиотика в организм может вызывать дисбактериозы, аллергические реакции, нарушать микрофлору кишечника, деятельность некоторых ферментов. Длительный прием способствует распространению устойчивых форм микроорганизмов. Следует также учитывать вероятность негативного влияния левомицетина на ряд технологических процессов при изготовлении кисломолочных продуктов [2]. Угнетение микроорганизмов закваски может изменить их органолептические и физико-химические свойства. Антимикробный эффект левомицетина вызван способностью подавлять синтез белка, присоединяясь к А-участку 508 субъединицы бактериальной рибосомы [3, 4].

В соответствии с Федеральным законом № 88 «Технический регламент на молоко и молочную продукцию» и СанПиН 2.3.2.1078-01 использование левомицетина в молочных хозяйствах запрещено, а его содержание в молоке и молочных продуктах допускается до 10 мкг/кг [5, 6]. Исходя из этого, методика идентификации и определе-

ния должна обладать достаточно высокой чувствительностью, чтобы обнаруживать концентрацию аналита по крайней мере на уровне 5 мкг/кг, что соответствует половине регламентируемой ПДК. Более того, необходимо чтобы методика позволяла отделять анализируемое соединение от мешающих компонентов матрицы, т.е. была селективна. Не менее важна точность методики, которая позволяет не только определять концентрации левомицетина в образцах, близкие к истинному значению, но и исключать возможность получения ложноположительных и ложноотри-цательных результатов. Методика должна быть надежной, т.е. есть способной в течение длительного времени сохранять определенные параметры в необходимых пределах. Существующая методика определения лемомицетина в пищевых продуктах ВЭЖХ [2] отвечает этим требованиям только частично.

Существует ряд методов, позволяющих определять левомицетин в матрицах различного состава [2, 7—16]. Преимущественно это методы газовой и жидкостной хроматографии. Также применяют тонкослойную хроматографию (ТСХ) и иммуноферментный анализ (ИФА). ИФА [2] позволяет обнаружить левомицетин на достаточно низком уровне 0.08 мкг/кг, однако требует дорогостоящих реактивов, градуировки перед каждой

сериеи анализов и проведения испытания в течение короткого промежутка времени. Метод ТСХ [14] характеризуется высоким пределом обнаружения по сравнению с хроматографическими методами — 1.00 мкг/кг. Он требует длительной и трудоемкой пробоподготовки, включающей многократную жидкость-жидкостную экстракцию, центрифугирование, концентрирование, получение производных и сопровождается значительными потерями аналита.

Наиболее точными и чувствительными являются методы газовой и высокоэффективной жидкостной хроматографии [2, 7—13, 15]. При реализации методов газовой хроматографии требуется предварительное получение летучих силилиро-ванных производных левомицетина [15]. Сигнал регистрируют либо детектором электронного захвата (ДЭЗ) благодаря наличию двух атомов хлора в молекуле аналита, либо масс-селективным детектором (МСД). Пределы обнаружения при применении ДЭЗ у разных авторов находились в диапазоне 0.05-1.00 мкг/кг, для МСД — 0.02-0.60 мкг/кг [15].

Описанные методики ВЭЖХ [2, 7-13, 15, 16] выполняли на обращенно-фазовом сорбенте с МСД и детектированием в УФ-области спектра. При определении нет необходимости в получении производных, однако использование спектро-фотометрического (СФД) или диодно-матричного (ДМД) детекторов требует многоступенчатой пробоподготовки из-за их низкой селективности. МСД решает проблему селективности, одновременно повышая чувствительность, однако его стоимость часто достигает уровня полноценной системы для жидкостной хроматографии. Пределы обнаружения для СФД и ДМД находились в диапазоне 0.65-50.00 мкг/кг, для МСД — 0.003-0.100 мкг/кг [2, 7-13, 15, 16].

Цель данной работы — разработка чувствительной, селективной, точной, надежной, соответствующей современным требованиям нормативных документов [5, 6], методики определения остаточных количеств левомицетина в сыром и пастеризованном коровьем молоке методом об-ращенно-фазовой ВЭЖХ.

возможностью смешивания до трех компонентов подвижной фазы, автоматическим пробоотборником с диапазоном ввода образца от 0.1 до 100 мкл, термостатом колонок, спектрофотометрическим детектором, позволяющим регистрировать аналитические сигналы на четырех длинах волн одновременно, и хроматографической рабочей станцией Chromeleon 6.80. УФ-спектр спиртового раствора левомицетина получали на спектрофотометре UNICO 2802PC.

Подготовка образцов. Молоко является сложной коллоидной полидисперсной системой, в состав которой входит до 200 различных химических соединений [17] как органической, так и неорганической природы, что требует тщательной очистки образца от мешающих компонентов и выбора условий разделения. Образцы молока отбирались согласно ГОСТ 26809-86 [18]. Образец пастеризованного молока или молока-сырья предварительно дважды пропускали через слой гигроскопической ваты. Для анализа отбирали 10 мл пробы и пропускали через предварительно подготовленный патрон Диапак С16. Белки и гидрофильные соединения элюировали 5 мл дистиллированной воды, жир и другие гидрофобные компоненты удаляли 5 мл гексана. Левоми-цетин с патрона элюировали 15 мл хлороформа, элюат упаривался в роторном испарителе досуха при температуре водяной бани не выше 45°C, концентрат растворяли в 1 мл смеси ацетонитри-ла, воды и изопропанола и очищали от остатков жира и гидрофобных соединений двукратной экстракцией по 1 мл гексана. Полученный раствор хроматографировали.

Для оценки степени извлечения левомицетина к 9 мл образца добавляли 1 мл водного раствора левомицетина с концентрацией 100 мкг/л (предельная допустимая концентрация левомицетина составляет 10 мкг/л). Образец с добавкой подвергали всем этапам пробоподготовки и хроматогра-фировали. Степень извлечения рассчитывали по формуле:

Реактивы. В качестве стандартного образца использовали левомицетин РСО 9348-152-00494189 (99.15% основного вещества). В работе применяли ацетонитрил ос.ч., 3 сорт (НПК «Криохром»), пропанол-2, н-гексан, хлороформ х.ч. (ЗАО «Экос-1»), спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья «Экстра» по ГОСТ Р 51652.

Оборудование. Хроматографическое определение проводили на хроматографической системе иШМа1е-3000 фирмы Dionex, укомплектованной вакуумным дегазатором, градиентным насосом с

где сх — концентрация левомицетина в образце с добавкой, полученная по градуировочному графику (мкг/л); cst — концентрация раствора левомицетина, введенного в образец (100 мкг/л).

Условия хроматографического определения:

предколонка (10 х 2.1 мм) Acclaim 120 (С18-фаза, 5 мкм, 120 А); колонка (150 х 2.1 мм) Acclaim 120 (С18-фаза, 3 мкм, 120 А); подвижная фаза ацетонитрил — 1.0%-ный (по объему) водный раствор пропанола-2 в объемном соотношении (15 : 85), режим элюирования изократический; расход подвижной фазы 0.2 мл/мин; температура термостата

ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ

колонок 30.0°С; объем пробы 40 мкл; длина волны детектора 278 нм, контроль при 254 нм.

Время удерживания левомицетина 27.7—28.6 мин.

Определение проводили методом внешнего стандарта. Из спиртового раствора левомицетина с концентрацией 100 мг/л готовили рабочий стандартный водный раствор с концентрацией 1000 мкг/л. Растворы для построения градуиро-вочного графика с концентрациями 50, 100, 250, 500 и 750 мкг/л готовили разбавлением стандартного раствора в мерных колбах вместимостью 10 мл подвижной фазой. Градуировочные растворы и рабочий стандартный раствор хроматогра-фировали в тех же условиях, что и исследуемые образцы молока. Для построения градуировочно-го графика готовили три серии растворов (всего 18 точек). Градуировочный график описывается уравнением y = 0.0063 + 0.0062х, где y — площадь пика, х — концентрация, мкг/л, с коэффициентом корреляции r2 = 0.99991.

УФ-спектр спиртового раствора с концентрацией 10 мг/л снимали относительно этанола в диапазоне 380—190 нм с шагом сканирования 1 нм в кюветах с l = 10 мм.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ

Выбор условий подготовки образцов и хромато-графического анализа. Необходимый уровень чувствительности методики достигали путем концентрирования аналита на патроне для твердофазной экстракции из 10 мл образца, упариванием элюата, введением в хроматограф большого объема пробы (40 мкл) и регистрацией аналитического сигнала в максимуме поглощения левомицетина. Спектр поглощения аналита имеет два максимума поглощения — при 216 и 278 нм (рис. 1).

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

КАРПОВ С.И., СЕЛЕМЕНЕВ В.Ф., ЧИРКИН В.А., ШУМСКИЙ Н.И. — 2013 г.

АМЕЛИН В.Г., ВОЛКОВА Н.М., НИКЕШИНА Т.Б., РЕПИН Н.А. — 2015 г.

ГАСИЛОВА Н.В., ЕРЕМИН С.А. — 2010 г.

АЛТУХОВА А.А., ДУРИЦИН Е.П., КИМ А.В., КОРОЛЕВ В.А., ШОРМАНОВ В.К. — 2010 г.

источник

Владельцы патента RU 2431829:

Группа изобретений относится к концентрированию и определению антибиотика левомицетина в пищевых продуктах методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Сущность изобретения: левомицетин экстрагируют из пробы ацетонитрилом, отделяют на центрифуге раствор, в котором находится антибиотик, к центрифугату добавляют сорбент — вермикулит при массовом соотношении вермикулита, равном 0,1 г сорбента на 1 г жира в пробе, и встряхивают в течение 30 минут, затем раствор отделяют и пропускают через смесь сорбентов — активированного угля и вермикулита, взятых в массовом соотношении, равном 1:1, и промывают дистиллированной водой, элюируют левомицетин этанолом, элюат упаривают досуха на водяной бане и охлаждают до комнатной температуры, затем остаток растворяют в подвижной фазе (ацетонитрил:вода, 70:30 об./об.), раствор левомицетина переносят дозатором в сухие виалы и количественно определяют левомицетин методом ОФ ВЭЖХ с УФ-детектированием при длине волны 278 нм; содержание антибиотика рассчитывают при помощи градуировочного графика. Достигается повышение точности и безопасности анализа. 2 н.п. ф-лы, 1 табл., 4 ил.

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам определения антибиотика левомицетина в пищевых продуктах методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Читайте также:  Случайно закапала левомицетин в нос

Антибиотики, в частности левомицетин (хлорамфеникол), используют в качестве эффективных противоинфекционных средств в ветеринарии и при профилактике заболеваний домашней птицы и скота. При этом антибиотик способен переходить в мясо, молоко животных, яйца птиц и другие пищевые продукты. Так как в последние годы в мире наблюдается устойчивая тенденция ужесточения требований к качеству пищевых продуктов, необходима разработка и введение в практику новых, более эффективных и чувствительных методов анализа.

Существуют различные методы определения левомицетина в пищевых продуктах (иммуноферментный анализ, химические методы (качественные реакции на данный антибиотик с различными специально подобранными реагентами), физико-химические методы (вольтамперометрия, полярография, спектрофотометрия), тонкослойная хроматография, газовая хроматография). При использовании данных методов анализа часто сталкиваются с определенными трудностями, например необходимостью использования специфических, редких и достаточно дорогостоящих реактивов; невозможностью определения сразу нескольких препаратов при совместном присутствии и неудовлетворительным нижним пределом обнаружения антибиотика; необходимостью использования предколонки (для газовой хроматографии).

Одним из наиболее перспективных методов определения антибиотика левомицетина является метод обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ), который дает возможность извлекать, разделять, идентифицировать и количественно определять лекарственные препараты в биологических жидкостях.

Известен способ количественного определения левомицетина в пищевых продуктах измерением массовой доли антибиотика методом ОФ ВЭЖХ с фотометрическим детектированием с использованием жидкостного хроматографа «Люмахром» [1]. Способ состоит в экстракции левомицетина из образца дистиллированной водой, дальнейшей очистке экстракта при помощи концентрирующего патрона ДИАПАК-C16 и в определении левомицетина методом ОФ ВЭЖХ с использованием фотометрического детектора (254 нм). Патроны ДИАПАК-С16 представляют собой корпусы из химически устойчивого полимера, заполненные высококачественными химически модифицированными сорбентами на основе силикагеля с привитыми гексадецильными группами. Способ имеет ряд недостатков: левомицетин из проб экстрагируется водой, что затрудняет дальнейший анализ, т.к. экстракты получаются достаточно загрязненными посторонними, мешающими определению антибиотика веществами; способ предполагает использование летучих и токсичных растворителей — хлороформа и гексана; определение левомицетина методом ОФ ВЭЖХ с ультрафиолетовым детектором проводят при длине волны 254 нм. Однако в этой области спектра интенсивное поглощение характерно для практически всех веществ, содержащих ароматический цикл; следовательно, известный метод определения левомицетина не гарантирует точных результатов.

Исследована возможность патронов ДИАПАК-C16 для концентрирования антибиотиков цефазолина и левомицетина из разбавленных растворов с последующим их определением методом ОФ-ВЭЖХ [2]. Сорбцию препаратов проводят в статическом и динамическом режимах, антибиотики десорбируют ацетонитрилом, полученные растворы анализируют методом ОФ ВЭЖХ с использованием подвижной фазы (ацетонитрил-вода, 50:50 об./об.); колонки Zorbax ODS C18 (15×0,46 см), рабочие длины волн — 210 и 254 нм. Однако данная методика позволяет осуществлять выделение и анализ антибиотиков из разбавленных водных растворов фармацевтических препаратов и не адаптирована для анализа пищевых продуктов с высоким содержанием жира.

Известен способ определения левомицетина в мясе краба и в креветках с помощью ВЭЖХ с масс-детектированием [3]. Антибиотик экстрагируют этилацетатом, в качестве подвижной фазы используют метанол. Недостатками данного способа являются: применение высокотоксичного метанола в качестве подвижной фазы; использование дорогостоящего и сложного в освоении жидкостного хроматографа с масс-детектором, что затрудняет широкое применение известного способа анализа.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к способу определения левомицетина в пищевых продуктах является способ извлечения антибиотиков из пищевой продукции органическими растворителями — метанолом и ацетонитрилом с последующей очисткой экстракта растворами Карреза (водный раствор Zn(СН3СОО)2 и K4[Fe(CN)6]×3H2O), после чего экстракт обрабатывают диэтиловым эфиром для удаления липидов и анализируют методом ОФ ВЭЖХ с использованием подвижной фазы (ацетонитрил:вода, 70:30 об./об.) (колонка Zorbax ODS C18 (15×0,46 см), с УФ-детектированием при 220, 254 и 273 нм) [4]. Количество антибиотика в пробе определяют с помощью градуировочного графика. Предел обнаружения антибиотика левомицетина в способе-прототипе составляет 0,9±0,2 нг в одной порции раствора, вводимой в хроматограф для анализа. Недостатками данного способа являются необходимость применения высокотоксичного реагента — метанола, а также недостаточная точность определения левомицетина вследствие частичного осаждения антибиотика на хлопьевидном осадке гексацианоферрата цинка.

Задачей заявляемого изобретения является разработка воспроизводимого, прецизионного способа выделения и концентрирования левомицетина из пищевых продуктов, а также его количественного определения.

Поставленная задача достигается тем, что левомицетин экстрагируют из пробы ацетонитрилом, отделяют на центрифуге раствор, в котором находится антибиотик, к центрифугату добавляют сорбент — вермикулит (массовое соотношение которого 0,1 г сорбента на 1 г жира в пробе) и встряхивают в течение 30 минут, затем раствор отделяют и пропускают через смесь сорбентов — активированного угля и вермикулита, взятых в массовом соотношении, равном 1:1, и промывают дистиллированной водой, элюируют левомицетин этанолом, элюат упаривают досуха на водяной бане и охлаждают до комнатной температуры, затем остаток растворяют в подвижной фазе (ацетонитрил:вода, 70:30 об./об.), раствор левомицетина переносят дозатором в сухие виалы и количественно определяют левомицетин методом ОФ ВЭЖХ с УФ-детектированием при длине волны 278 нм; содержание антибиотика рассчитывают при помощи градуировочного графика.

Поставленная задача наилучшим образом решается новыми, ранее не известными из уровня техники условиями пробоподготовки образца, а именно:

— последовательным применением сорбентов:

— вначале — вермикулита, массовое соотношение которого 0,1 г сорбента на 1 г жира в пробе;

— затем — смеси активированного угля и вермикулита при их массовом соотношении, равном 1:1;

— последующей переэкстракцией антибиотика этанолом.

В заявляемом способе используют вермикулит (природный цеолит) Кокшаровского месторождения Приморского края.

Указанные существенные отличительные признаки заявляемого изобретения обеспечивают концентрирование антибиотика, очистку экстракта от мешающих анализу компонентов, что особенно актуально при анализе пищевых продуктов с высоким (>30%) содержанием жира, и позволяют определить левомицетин известным ОФ ВЭЖХ-методом с достаточной степенью точности.

Техническим результатом предлагаемого способа определения содержания левомицетина в пищевых продуктах является повышение точности количественного определения антибиотика в пищевых продуктах с различным содержанием жира, а также снижение токсичности проведения аналитических исследований.

Способ определения содержания левомицетина в пищевых продуктах осуществляют следующим образом. Левомицетин экстрагируют из пробы ацетонитрилом и отделяют раствор, в котором находится антибиотик с примесями, от осадка (свернувшийся белок). В полученный раствор антибиотика в ацетонитриле добавляют вермикулит, массовое соотношение которого 0,1 г сорбента на 1 г жира в пробе, встряхивают колбу со смесью в течение 30 минут на встряхивателе и отделяют раствор от сорбента. Отфильтрованный раствор пропускают через смесь сорбентов (активированный уголь и вермикулит, взятых при массовом соотношении, равном 1:1), промывают дистиллированной водой и элюируют антибиотик этанолом. Элюат в круглодонных колбах упаривают досуха на водяной бане, охлаждают до комнатной температуры и растворяют в подвижной фазе (ацетонитрил:вода, 70:30 об./об.). Раствор левомицетина переносят дозатором в сухие виалы и количественно определяют антибиотик методом ОФ ВЭЖХ с УФ-детектированием при длине волны 278 нм; содержание антибиотика рассчитывают при помощи градуировочного графика.

Экспериментально установлена необходимость последовательного применения сорбентов: вначале — вермикулита для дополнительной очистки экстракта от примесей. Необходимость использования вермикулита при его массовом соотношении, равном 0,1 г сорбента на 1 г жира в пробе, подтверждена экспериментальным путем и обусловлена тем, что при статической сорбции из раствора на вермикулите происходит сорбция примесей (липиды, белки и др.), которые присутствуют в экстракте. Таким образом, достигается предварительная очистка экстракта от балластных веществ.

Для сорбции левомицетина из раствора после отделения вермикулита используется бинарный сорбент (активированный уголь и вермикулит при их массовом соотношении, равном 1:1), применение которого позволяет не только проводить доочистку экстракта от соэкстрагированных примесей, но и концентрировать левомицетин в количествах, необходимых для хроматографического анализа. Активированный уголь сорбирует примеси из раствора левомицетина в этаноле, обеспечивает получение прозрачного и пригодного для ОФ ВЭЖХ-анализа раствора левомицетина. Для того чтобы минимизировать возможность сорбции антибиотика на угле, необходимое количество активированного угля предварительно рассчитывают по формуле (1), если содержание жира в продукте ≥3,9%; и по формуле (2), если содержание жира в продукте меньше чем 3,9%:

mR — масса остатка после экстракции ацетонитрилом;

f — содержание жира в исследуемом продукте.

где mS2 — масса сорбента, необходимая для анализа пищевого продукта, с содержанием жира менее 3,9%,

f — содержание жира в исследуемом продукте.

После расчета навески активированного угля, необходимой для анализа продукта на левомицетин, готовят смесь сорбентов при их массовом соотношении, равном 1:1; такое соотношение сорбентов является оптимальным и установлено экспериментально.

Изменение соотношения активированный уголь:вермикулит приводит либо к уменьшению степени извлечения антибиотика, либо к получению мутных растворов, непригодных для анализа методом ОФ ВЭЖХ.

Элюирование левомицетина осуществляется этанолом, поскольку этот растворитель обладает достаточной полярностью для наиболее полного элюирования левомицетина с сорбента. Менее полярные растворители извлекают с сорбента и неполярные примеси, что приводит к уменьшению точности анализа антибиотика заявляемым способом. Не маловажным при выборе растворителя на стадии элюирования левомицетина является меньшая токсичность этанола по сравнению с метанолом, используемым в способе-прототипе.

Заявляемый способ впервые позволяет анализировать пищевые продукты с различным содержанием жира — от 1,0% до 60% с достаточно высокой степенью извлечения антибиотика, а именно (98,5-90)%, что подтверждается данными таблицы.

Степень извлечения левомицетина из продуктов с различным содержанием жира
Исследуемый продукт Жирность исследуемого продукта, % Степень извлечения, %
Маргарин 1 60,0 88,9 89,3
Маргарин 2 40,0 91,2 90,9
Молоко 3,9 96,4 97,1
Яйца куриные 1,2 98,7 98,9

Правильность предлагаемого способа определения содержания левомицетина в пищевых продуктах подтверждена методом «введено-найдено» и экспериментальными данными (примеры 1-3); хроматограммы представлены на фигурах 1-4.

На фиг.1 представлена хроматограмма стандартного раствора левомицетина с концентрацией антибиотика 0,01 мг/мл, приготовленного из фармацевтического препарата «Хлорамфеникола натрия сукцинат», приобретенного в аптечной сети. Пик вещества со временем удерживания 2,492 мин принят за пик левомицетина.

На фиг.2 представлена хроматограмма раствора левомицетина с концентрацией 0,01 мг/мл, внесенного в пищевой продукт (растительный маргарин, жирностью 40%) и выделенного из него по заявляемому способу. Пик вещества со временем удерживания 2,429 мин принят за пик левомицетина.

На фиг.3 представлена хроматограмма раствора левомицетина, выделенного по заявляемому способу из пищевого продукта «яйцо куриное». Пик вещества со временем удерживания 2,418 мин принят за пик левомицетина.

На фиг.4 представлена хроматограмма раствора левомицетина с концентрацией 0,01 мг/мл, внесенного в пищевой продукт (растительный маргарин, жирностью 60%) и выделенного из него по заявляемому способу. Пик вещества со временем удерживания 2,437 мин принят за пик левомицетина.

Возможность осуществления заявляемого способа иллюстрируется примерами.

Пример 1. Определение левомицетина (хлорамфеникола) в яйцах куриных

В коническую колбу вместимостью 100,0 мл вносят 50 г куриных яиц, предварительно тщательно гомогенизированных в стеклянной посуде, приливают 100 мл ацетонитрила (хч) и ставят на встряхиватель на 2 часа. Полученный экстракт фильтруют через стекловату, помещенную в стеклянную воронку и промытую 5 мл ацетонитрила. В полученный раствор добавляют 1 г вермикулита. Колбу с экстрактом и сорбентом помещают на встряхиватель на 30 минут, фильтруют раствор и пропускают через бинарный сорбент — смесь 3,85 г активированного угля и 3,85 г вермикулита, после чего сорбенты промывают 10 мл дистиллированной воды. Затем левомицетин элюируют 10 мл этанола и упаривают раствор на водяной бане в круглодонной колбе досуха. Колбу охлаждают на воздухе до комнатной температуры и ополаскивают 1 мл подвижной фазы (ацетонитрил:вода, 70:30 об./об.). Раствор антибиотика в подвижной фазе собирают дозатором на 1000 мкл и переносят в сухую чистую виалу. Количество антибиотика находят методом ОФ ВЭЖХ (жидкостный хроматограф Shimadzu LC-6A с УФ-детектором, колонка Zorbax ODS C18 (15×0,46 см), подвижная фаза (ацетонитрил:вода, 70:30 об./об.) при рабочей длине волны 278 нм. Содержание левомицетина (мг/кг), рассчитанное по методу градуировочного графика составило: 0,0140±0,0011 мг/кг; степень извлечения — 98,9% (фиг.3).

Пример 2. Определение левомицетина в маргарине с жирностью 40,0%

Определение антибиотика проводили по примеру 1, но перед экстракцией 50 г маргарина растопили в колбе при температуре 55°С (достаточная температура, чтобы растопить жир, содержащийся в маргарине, и не разрушить антибиотик), добавили 1 мл раствора левомицетина с концентрацией 0,1 мг/мл. Затем, не охлаждая образец, прибавили 100 мл ацетонитрила и проводили экстракцию левомицетина на встряхивателе в течение 3 часов при температуре 50°С. В полученный раствор добавили 1 г вермикулита. Колбу с экстрактом и сорбентом помещали на встряхиватель на 30 минут, отфильтровывали раствор и пропускали через бинарный сорбент — смесь 27,0 г активированного угля и 27,0 г вермикулита. Далее — по примеру 1. Содержание левомицетина составило 0,09105 мг/кг; степень извлечения — 91% (фиг.2).

Пример 3. Определение содержания левомицетина в маргарине жирностью 60,0% Количество внесенного антибиотика такое же, как в примере 2. Время экстракции ацетонитрилом — 4 часа. Бинарный сорбент — 40,5 г активированного угля и 45,5 г вермикулита. Содержание левомицетина составило 0,0891 мг/кг; степень извлечения — 89% (фиг.4).

Экспериментально установлено, что в зависимости от содержания жира в продукте время экстракции необходимо изменять. Для продуктов с содержанием жира от 1 до 10% оно составляет 2 часа, для продуктов с содержанием жира от 10 до 40% — 3 часа, выше 40% — 4 часа. Увеличение времени экстракции более 4 часов не приводит к увеличению степени извлечения антибиотика; при времени экстракции менее 2 часов экстракция левомицетина не является полной.

Заявляемый способ выделения, концентрирования и идентификации антибиотика левомицетина (хлорамфеникола) прост, не трудоемок, не требует большого количества реактивов и может быть применен в любой химической лаборатории, где имеется жидкостный хроматограф с УФ-детектором. Погрешность измерения составляет 3-4% для концентрации до 0,01 мг/кг и 10% для больших концентраций.

1. № М 01-28-2002. «Методика выполнения измерений массовой доли левомицетина (хлорамфеникола) в продуктах животного происхождения методом ОФ ВЭЖХ с фотометрическим детектированием с использованием жидкостного хроматографа «Люмахром»». — г.Санкт-Петербург: ООО «Люмэкс», 2008.

2. Концентрирование антибиотиков цефазолина, цефотаксима и левомицетина на модифицированных кремнеземах. / Л.И.Соколова, И.В.Чучалина. // Журнал аналитической химии. — 2006. — Т.61, №12, с.1238-1242.

3. Rupp. H.S. Liquid chromatography/tandem mass spectrometry analysis of chloramphenicol in cooked crabmeat / H.S.Rupp, J.S.Stuart, J.A.Hurlbut // Journal of AOAC International. — 2005. — Vol.88, N 4. — PP.1155-1159.

4. Определение бензилпенициллина, левомицетина и тетрациклина в пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. / Л.И.Соколова, А.П.Черняев. // Журнал аналитической химии. — 2001. — Т.56, №11, с.1177-1180.

1. Способ определения содержания левомицетина в пищевых продуктах, включающий экстракцию левомицетина из пробы ацетонитрилом, отделение от осадка раствора, содержащего левомицетин, очистку раствора сорбентом-вермикулитом при массовом соотношении 0,1 г сорбента на 1 г жира в пробе, доочистку раствора и концентрирование из него левомицетина при пропускании через сорбент в виде смеси активированного угля и вермикулита при их массовом соотношении 1:1, десорбцию левомицетина при элюировании этанолом, упаривание элюата с последующим растворением охлажденного остатка в подвижной фазе ацетонитрил-вода при их объемном соотношении 70:30, анализ полученного раствора методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии и расчет содержания левомицетина при помощи градуировочного графика.

2. Сорбент для осуществления способа по п.1, содержащий активированный уголь и вермикулит при их массовом соотношении, равном 1:1.

источник