Количественное определение левомицетина в мясе

Левомицетин (хлорамфеникол, хлоромицетин) – это антибиотик широкого спектра действия. Он обладает бактериостатическим действием и эффективен против возбудителей таких заболеваний, как дизентерия, брюшной тиф, пневмония, газовая гангрена, сибирская язва бактерий рода Yersinia (возбудители иерсиниоза, псевдотуберкулеза и чумы) и многих других опасных микроорганизмов. Хлорамфеникол очень хорошо растворяется в жирах и в значительных количествах выделяется с молоком. Его молекула имеет небольшие размеры, и это, вместе с жирорастворимостью, позволяет ему легко проникать во все ткани тела, в том числе, в мозг.

ВОЗ рекомендует использовать масляную суспензию хлорамфеникола в качестве первой линии терапии менингита в странах с низким уровнем дохода. В форме мазей для наружного использования он применяется при фурункулезе и других кожных заболеваниях, а также при ранениях. Многие лечат с помощью левомицетина пищевые токсикоинфекции («пищевые отравления»). Согласно источникам, хлорамфеникол проявляет активность в отношении некоторых крупных вирусов. При этом микроорганизмы очень медленно вырабатывают резистентность к нему, потому левомицетин остается очень эффективным антибиотиком.

В сельском хозяйстве и ветеринарии левомицетин применяется для лечения животных и птицы, больных желудочно-кишечными заболеваниями, в том числе, кокцидиозом, который вызывают паразиты. Также его используют для лечения заболеваний дыхательных путей.

Впервые хлорамфеникол выделили в 1947 году из культуры почвенного микроорганизма Streptomyces venezuelae. В клинической практике он используется с 1949 года. Позднее левомицетин научились синтезировать искусственным путем, и в настоящее время его получают именно таким способом.

В России хлорамфеникол входит в список жизненно необходимых и важнейших лекарственных препаратов и применяется в животноводстве и ветеринарии. В США левомицетин не выпускается для перорального употребления с 1991 года. В странах Евросоюза использование этого средства в животноводстве запрещено. Рекомендации применять хлорамфеникол только для лечения тяжелых заболеваний, запреты на его использование в животноводстве или необходимость контролировать содержание левомицетина в пищевых продуктах связаны с побочными эффектами этого средства, возникающими при хроническом воздействии на человека. Одним из таких эффектов являются реакции гиперчувствительности вплоть до анафилактического шока. Но чаще они выражаются в крапивнице и других кожных проявлениях, особенно при использовании мазей с левомицетином.

Левомицетин метаболизируется в печени с образованием глюкоронида хлорамфеникола – неактивного соединения. В этом виде он выводится почками. Хлорамфеникол ингибирует активность одного из ферментов печени, участвующего в обмене стероидов и некоторых других соединений, а также в нейтрализации токсичных веществ, что нарушает работу печени. В некоторых случаях левомицетин вызывать почечные кровотечения. Хлорамфеникол долгое время остается в организме животных и в пищевых продуктах, в том числе, в мясе и молоке.

Длительное употребление левомицетина в высоких дозировках может вызывать желудочно-кишечные расстройства, раздражение слизистых оболочек рта и желудочно-кишечного тракта, а также возникновение язв на них. Кроме того, он подавляет микрофлору кишечника, что часто приводит к расстройствам пищеварения или вторичной грибковой инфекции.

Самые опасные эффекты хронического употребления левомицетина связаны с его воздействием на кроветворную систему. Он вызывает апластическую анемию (атрофию кроветворения): неизлечимое заболевание, вызванное повреждением клеток костного мозга. При ней снижается количество всех трех типов клеток крови: лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов. Это редкое осложнение, и при употреблении левомицетина оно чаще всего возникает, если это средство применяли перорально. К другим осложнениям со стороны кроветворной системы относится подавление работы костного мозга, а также лейкемия («рак крови»). Чаще всего такая реакция возникает у детей, причем риск ее возникновения увеличивается с увеличением длительности употребления левомицетина.

Дозы левомицетина, способные вызывать побочные эффекты, в том числе, апластическую анемию, до сих пор не определены. Поэтому в странах Евросоюза использование левомицетина при производстве пищевых продуктов животного происхождения запрещено. Минимальный предел чувствительности методов анализа, с помощью которых в Евросоюзе допускается проводить определение левомицетина (хлорамфеникола) в пище составляет 0,3 мкг/кг.

Согласно гигиеническим требованиям к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, принятым в Российской Федерации и странах Таможенного Союза, в соответствии с Техническим Регламентом Таможенного Союза ТР ТС 021/2011 («О безопасности пищевой продукции») содержание левомицетина (хлорамфеникола) в яйцах, мясе и других продуктов не допускается (должно быть менее 0,01 мг/кг, или 10 мкг/кг). Такие же нормы установлены для молочных продуктов Техническим Регламентом Таможенного Союза ТР ТС 033/2013 «О безопасности молока и молочной продукции». С 1 июля 2015 года, согласно ТР ТС 033/2013, максимально допустимое содержание левомицетина в молоке не должно превышать 0,0003 мг/кг (0,3 мкг/кг), что соответствует также нормам Евросоюза. С актуальными законодательными нормативами можно ознакомиться на сайте compact24.com.

Остаточные количества левомицетина (хлорамфеникола) в пищевых продуктах можно определять методами радиоиммуного анализа и жидкостной хроматографии высокого давления. Однако данные методы реализуются на дорогостоящем оборудовании и занимают длительное время. Кроме того, радиоиммунный метод анализа предполагает использование радиоактивных материалов, а хроматографические методы требуют квалифицированного обслуживания и трудоемки. Микробиологические методы определения антибиотиков, в том числе, левомицетина, просты и дешевы, но недостаточно специфичны, поскольку многие микроорганизмы чувствительны к различным антибиотикам.

Для скрининга и в рутинной лабораторной практике широко применяют иммуноферментный метод анализа. Например, с сентября 1998 г. в Германии ИФА является официальным методом скрининга остатков левомицетина в молоке; см.§ 35 LMBG, 01.00 68. В Белоруссии утверждены МУК 10-1-5/118/В от 18.08.2003 по контролю левомицетина в молоке, сухом молоке, яйцах и мясе с помощью тест-системы RIDASCREEN® Chloramphenicol. В России метод иммуноферментного анализа для определения левомицетина в пищевых продуктах утвержден МУК 4.1.1912-04.

источник

Владельцы патента RU 2431829:

Группа изобретений относится к концентрированию и определению антибиотика левомицетина в пищевых продуктах методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Сущность изобретения: левомицетин экстрагируют из пробы ацетонитрилом, отделяют на центрифуге раствор, в котором находится антибиотик, к центрифугату добавляют сорбент — вермикулит при массовом соотношении вермикулита, равном 0,1 г сорбента на 1 г жира в пробе, и встряхивают в течение 30 минут, затем раствор отделяют и пропускают через смесь сорбентов — активированного угля и вермикулита, взятых в массовом соотношении, равном 1:1, и промывают дистиллированной водой, элюируют левомицетин этанолом, элюат упаривают досуха на водяной бане и охлаждают до комнатной температуры, затем остаток растворяют в подвижной фазе (ацетонитрил:вода, 70:30 об./об.), раствор левомицетина переносят дозатором в сухие виалы и количественно определяют левомицетин методом ОФ ВЭЖХ с УФ-детектированием при длине волны 278 нм; содержание антибиотика рассчитывают при помощи градуировочного графика. Достигается повышение точности и безопасности анализа. 2 н.п. ф-лы, 1 табл., 4 ил.

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам определения антибиотика левомицетина в пищевых продуктах методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Антибиотики, в частности левомицетин (хлорамфеникол), используют в качестве эффективных противоинфекционных средств в ветеринарии и при профилактике заболеваний домашней птицы и скота. При этом антибиотик способен переходить в мясо, молоко животных, яйца птиц и другие пищевые продукты. Так как в последние годы в мире наблюдается устойчивая тенденция ужесточения требований к качеству пищевых продуктов, необходима разработка и введение в практику новых, более эффективных и чувствительных методов анализа.

Существуют различные методы определения левомицетина в пищевых продуктах (иммуноферментный анализ, химические методы (качественные реакции на данный антибиотик с различными специально подобранными реагентами), физико-химические методы (вольтамперометрия, полярография, спектрофотометрия), тонкослойная хроматография, газовая хроматография). При использовании данных методов анализа часто сталкиваются с определенными трудностями, например необходимостью использования специфических, редких и достаточно дорогостоящих реактивов; невозможностью определения сразу нескольких препаратов при совместном присутствии и неудовлетворительным нижним пределом обнаружения антибиотика; необходимостью использования предколонки (для газовой хроматографии).

Одним из наиболее перспективных методов определения антибиотика левомицетина является метод обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ), который дает возможность извлекать, разделять, идентифицировать и количественно определять лекарственные препараты в биологических жидкостях.

Известен способ количественного определения левомицетина в пищевых продуктах измерением массовой доли антибиотика методом ОФ ВЭЖХ с фотометрическим детектированием с использованием жидкостного хроматографа «Люмахром» [1]. Способ состоит в экстракции левомицетина из образца дистиллированной водой, дальнейшей очистке экстракта при помощи концентрирующего патрона ДИАПАК-C₁₆ и в определении левомицетина методом ОФ ВЭЖХ с использованием фотометрического детектора (254 нм). Патроны ДИАПАК-С₁₆ представляют собой корпусы из химически устойчивого полимера, заполненные высококачественными химически модифицированными сорбентами на основе силикагеля с привитыми гексадецильными группами. Способ имеет ряд недостатков: левомицетин из проб экстрагируется водой, что затрудняет дальнейший анализ, т.к. экстракты получаются достаточно загрязненными посторонними, мешающими определению антибиотика веществами; способ предполагает использование летучих и токсичных растворителей — хлороформа и гексана; определение левомицетина методом ОФ ВЭЖХ с ультрафиолетовым детектором проводят при длине волны 254 нм. Однако в этой области спектра интенсивное поглощение характерно для практически всех веществ, содержащих ароматический цикл; следовательно, известный метод определения левомицетина не гарантирует точных результатов.

Исследована возможность патронов ДИАПАК-C₁₆ для концентрирования антибиотиков цефазолина и левомицетина из разбавленных растворов с последующим их определением методом ОФ-ВЭЖХ [2]. Сорбцию препаратов проводят в статическом и динамическом режимах, антибиотики десорбируют ацетонитрилом, полученные растворы анализируют методом ОФ ВЭЖХ с использованием подвижной фазы (ацетонитрил-вода, 50:50 об./об.); колонки Zorbax ODS C₁₈ (15×0,46 см), рабочие длины волн — 210 и 254 нм. Однако данная методика позволяет осуществлять выделение и анализ антибиотиков из разбавленных водных растворов фармацевтических препаратов и не адаптирована для анализа пищевых продуктов с высоким содержанием жира.

Известен способ определения левомицетина в мясе краба и в креветках с помощью ВЭЖХ с масс-детектированием [3]. Антибиотик экстрагируют этилацетатом, в качестве подвижной фазы используют метанол. Недостатками данного способа являются: применение высокотоксичного метанола в качестве подвижной фазы; использование дорогостоящего и сложного в освоении жидкостного хроматографа с масс-детектором, что затрудняет широкое применение известного способа анализа.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к способу определения левомицетина в пищевых продуктах является способ извлечения антибиотиков из пищевой продукции органическими растворителями — метанолом и ацетонитрилом с последующей очисткой экстракта растворами Карреза (водный раствор Zn(СН₃СОО)₂ и K₄[Fe(CN)₆]×3H₂O), после чего экстракт обрабатывают диэтиловым эфиром для удаления липидов и анализируют методом ОФ ВЭЖХ с использованием подвижной фазы (ацетонитрил:вода, 70:30 об./об.) (колонка Zorbax ODS C₁₈ (15×0,46 см), с УФ-детектированием при 220, 254 и 273 нм) [4]. Количество антибиотика в пробе определяют с помощью градуировочного графика. Предел обнаружения антибиотика левомицетина в способе-прототипе составляет 0,9±0,2 нг в одной порции раствора, вводимой в хроматограф для анализа. Недостатками данного способа являются необходимость применения высокотоксичного реагента — метанола, а также недостаточная точность определения левомицетина вследствие частичного осаждения антибиотика на хлопьевидном осадке гексацианоферрата цинка.

Задачей заявляемого изобретения является разработка воспроизводимого, прецизионного способа выделения и концентрирования левомицетина из пищевых продуктов, а также его количественного определения.

Поставленная задача достигается тем, что левомицетин экстрагируют из пробы ацетонитрилом, отделяют на центрифуге раствор, в котором находится антибиотик, к центрифугату добавляют сорбент — вермикулит (массовое соотношение которого 0,1 г сорбента на 1 г жира в пробе) и встряхивают в течение 30 минут, затем раствор отделяют и пропускают через смесь сорбентов — активированного угля и вермикулита, взятых в массовом соотношении, равном 1:1, и промывают дистиллированной водой, элюируют левомицетин этанолом, элюат упаривают досуха на водяной бане и охлаждают до комнатной температуры, затем остаток растворяют в подвижной фазе (ацетонитрил:вода, 70:30 об./об.), раствор левомицетина переносят дозатором в сухие виалы и количественно определяют левомицетин методом ОФ ВЭЖХ с УФ-детектированием при длине волны 278 нм; содержание антибиотика рассчитывают при помощи градуировочного графика.

Поставленная задача наилучшим образом решается новыми, ранее не известными из уровня техники условиями пробоподготовки образца, а именно:

— последовательным применением сорбентов:

— вначале — вермикулита, массовое соотношение которого 0,1 г сорбента на 1 г жира в пробе;

— затем — смеси активированного угля и вермикулита при их массовом соотношении, равном 1:1;

— последующей переэкстракцией антибиотика этанолом.

В заявляемом способе используют вермикулит (природный цеолит) Кокшаровского месторождения Приморского края.

Указанные существенные отличительные признаки заявляемого изобретения обеспечивают концентрирование антибиотика, очистку экстракта от мешающих анализу компонентов, что особенно актуально при анализе пищевых продуктов с высоким (>30%) содержанием жира, и позволяют определить левомицетин известным ОФ ВЭЖХ-методом с достаточной степенью точности.

Техническим результатом предлагаемого способа определения содержания левомицетина в пищевых продуктах является повышение точности количественного определения антибиотика в пищевых продуктах с различным содержанием жира, а также снижение токсичности проведения аналитических исследований.

Способ определения содержания левомицетина в пищевых продуктах осуществляют следующим образом. Левомицетин экстрагируют из пробы ацетонитрилом и отделяют раствор, в котором находится антибиотик с примесями, от осадка (свернувшийся белок). В полученный раствор антибиотика в ацетонитриле добавляют вермикулит, массовое соотношение которого 0,1 г сорбента на 1 г жира в пробе, встряхивают колбу со смесью в течение 30 минут на встряхивателе и отделяют раствор от сорбента. Отфильтрованный раствор пропускают через смесь сорбентов (активированный уголь и вермикулит, взятых при массовом соотношении, равном 1:1), промывают дистиллированной водой и элюируют антибиотик этанолом. Элюат в круглодонных колбах упаривают досуха на водяной бане, охлаждают до комнатной температуры и растворяют в подвижной фазе (ацетонитрил:вода, 70:30 об./об.). Раствор левомицетина переносят дозатором в сухие виалы и количественно определяют антибиотик методом ОФ ВЭЖХ с УФ-детектированием при длине волны 278 нм; содержание антибиотика рассчитывают при помощи градуировочного графика.

Экспериментально установлена необходимость последовательного применения сорбентов: вначале — вермикулита для дополнительной очистки экстракта от примесей. Необходимость использования вермикулита при его массовом соотношении, равном 0,1 г сорбента на 1 г жира в пробе, подтверждена экспериментальным путем и обусловлена тем, что при статической сорбции из раствора на вермикулите происходит сорбция примесей (липиды, белки и др.), которые присутствуют в экстракте. Таким образом, достигается предварительная очистка экстракта от балластных веществ.

Для сорбции левомицетина из раствора после отделения вермикулита используется бинарный сорбент (активированный уголь и вермикулит при их массовом соотношении, равном 1:1), применение которого позволяет не только проводить доочистку экстракта от соэкстрагированных примесей, но и концентрировать левомицетин в количествах, необходимых для хроматографического анализа. Активированный уголь сорбирует примеси из раствора левомицетина в этаноле, обеспечивает получение прозрачного и пригодного для ОФ ВЭЖХ-анализа раствора левомицетина. Для того чтобы минимизировать возможность сорбции антибиотика на угле, необходимое количество активированного угля предварительно рассчитывают по формуле (1), если содержание жира в продукте ≥3,9%; и по формуле (2), если содержание жира в продукте меньше чем 3,9%:

m_R — масса остатка после экстракции ацетонитрилом;

f — содержание жира в исследуемом продукте.

где m_S2 — масса сорбента, необходимая для анализа пищевого продукта, с содержанием жира менее 3,9%,

f — содержание жира в исследуемом продукте.

После расчета навески активированного угля, необходимой для анализа продукта на левомицетин, готовят смесь сорбентов при их массовом соотношении, равном 1:1; такое соотношение сорбентов является оптимальным и установлено экспериментально.

Изменение соотношения активированный уголь:вермикулит приводит либо к уменьшению степени извлечения антибиотика, либо к получению мутных растворов, непригодных для анализа методом ОФ ВЭЖХ.

Элюирование левомицетина осуществляется этанолом, поскольку этот растворитель обладает достаточной полярностью для наиболее полного элюирования левомицетина с сорбента. Менее полярные растворители извлекают с сорбента и неполярные примеси, что приводит к уменьшению точности анализа антибиотика заявляемым способом. Не маловажным при выборе растворителя на стадии элюирования левомицетина является меньшая токсичность этанола по сравнению с метанолом, используемым в способе-прототипе.

Заявляемый способ впервые позволяет анализировать пищевые продукты с различным содержанием жира — от 1,0% до 60% с достаточно высокой степенью извлечения антибиотика, а именно (98,5-90)%, что подтверждается данными таблицы.

Правильность предлагаемого способа определения содержания левомицетина в пищевых продуктах подтверждена методом «введено-найдено» и экспериментальными данными (примеры 1-3); хроматограммы представлены на фигурах 1-4.

На фиг.1 представлена хроматограмма стандартного раствора левомицетина с концентрацией антибиотика 0,01 мг/мл, приготовленного из фармацевтического препарата «Хлорамфеникола натрия сукцинат», приобретенного в аптечной сети. Пик вещества со временем удерживания 2,492 мин принят за пик левомицетина.

На фиг.2 представлена хроматограмма раствора левомицетина с концентрацией 0,01 мг/мл, внесенного в пищевой продукт (растительный маргарин, жирностью 40%) и выделенного из него по заявляемому способу. Пик вещества со временем удерживания 2,429 мин принят за пик левомицетина.

На фиг.3 представлена хроматограмма раствора левомицетина, выделенного по заявляемому способу из пищевого продукта «яйцо куриное». Пик вещества со временем удерживания 2,418 мин принят за пик левомицетина.

На фиг.4 представлена хроматограмма раствора левомицетина с концентрацией 0,01 мг/мл, внесенного в пищевой продукт (растительный маргарин, жирностью 60%) и выделенного из него по заявляемому способу. Пик вещества со временем удерживания 2,437 мин принят за пик левомицетина.

Возможность осуществления заявляемого способа иллюстрируется примерами.

Пример 1. Определение левомицетина (хлорамфеникола) в яйцах куриных

В коническую колбу вместимостью 100,0 мл вносят 50 г куриных яиц, предварительно тщательно гомогенизированных в стеклянной посуде, приливают 100 мл ацетонитрила (хч) и ставят на встряхиватель на 2 часа. Полученный экстракт фильтруют через стекловату, помещенную в стеклянную воронку и промытую 5 мл ацетонитрила. В полученный раствор добавляют 1 г вермикулита. Колбу с экстрактом и сорбентом помещают на встряхиватель на 30 минут, фильтруют раствор и пропускают через бинарный сорбент — смесь 3,85 г активированного угля и 3,85 г вермикулита, после чего сорбенты промывают 10 мл дистиллированной воды. Затем левомицетин элюируют 10 мл этанола и упаривают раствор на водяной бане в круглодонной колбе досуха. Колбу охлаждают на воздухе до комнатной температуры и ополаскивают 1 мл подвижной фазы (ацетонитрил:вода, 70:30 об./об.). Раствор антибиотика в подвижной фазе собирают дозатором на 1000 мкл и переносят в сухую чистую виалу. Количество антибиотика находят методом ОФ ВЭЖХ (жидкостный хроматограф Shimadzu LC-6A с УФ-детектором, колонка Zorbax ODS C₁₈ (15×0,46 см), подвижная фаза (ацетонитрил:вода, 70:30 об./об.) при рабочей длине волны 278 нм. Содержание левомицетина (мг/кг), рассчитанное по методу градуировочного графика составило: 0,0140±0,0011 мг/кг; степень извлечения — 98,9% (фиг.3).

Пример 2. Определение левомицетина в маргарине с жирностью 40,0%

Определение антибиотика проводили по примеру 1, но перед экстракцией 50 г маргарина растопили в колбе при температуре 55°С (достаточная температура, чтобы растопить жир, содержащийся в маргарине, и не разрушить антибиотик), добавили 1 мл раствора левомицетина с концентрацией 0,1 мг/мл. Затем, не охлаждая образец, прибавили 100 мл ацетонитрила и проводили экстракцию левомицетина на встряхивателе в течение 3 часов при температуре 50°С. В полученный раствор добавили 1 г вермикулита. Колбу с экстрактом и сорбентом помещали на встряхиватель на 30 минут, отфильтровывали раствор и пропускали через бинарный сорбент — смесь 27,0 г активированного угля и 27,0 г вермикулита. Далее — по примеру 1. Содержание левомицетина составило 0,09105 мг/кг; степень извлечения — 91% (фиг.2).

Пример 3. Определение содержания левомицетина в маргарине жирностью 60,0% Количество внесенного антибиотика такое же, как в примере 2. Время экстракции ацетонитрилом — 4 часа. Бинарный сорбент — 40,5 г активированного угля и 45,5 г вермикулита. Содержание левомицетина составило 0,0891 мг/кг; степень извлечения — 89% (фиг.4).

Экспериментально установлено, что в зависимости от содержания жира в продукте время экстракции необходимо изменять. Для продуктов с содержанием жира от 1 до 10% оно составляет 2 часа, для продуктов с содержанием жира от 10 до 40% — 3 часа, выше 40% — 4 часа. Увеличение времени экстракции более 4 часов не приводит к увеличению степени извлечения антибиотика; при времени экстракции менее 2 часов экстракция левомицетина не является полной.

Заявляемый способ выделения, концентрирования и идентификации антибиотика левомицетина (хлорамфеникола) прост, не трудоемок, не требует большого количества реактивов и может быть применен в любой химической лаборатории, где имеется жидкостный хроматограф с УФ-детектором. Погрешность измерения составляет 3-4% для концентрации до 0,01 мг/кг и 10% для больших концентраций.

1. № М 01-28-2002. «Методика выполнения измерений массовой доли левомицетина (хлорамфеникола) в продуктах животного происхождения методом ОФ ВЭЖХ с фотометрическим детектированием с использованием жидкостного хроматографа «Люмахром»». — г.Санкт-Петербург: ООО «Люмэкс», 2008.

2. Концентрирование антибиотиков цефазолина, цефотаксима и левомицетина на модифицированных кремнеземах. / Л.И.Соколова, И.В.Чучалина. // Журнал аналитической химии. — 2006. — Т.61, №12, с.1238-1242.

3. Rupp. H.S. Liquid chromatography/tandem mass spectrometry analysis of chloramphenicol in cooked crabmeat / H.S.Rupp, J.S.Stuart, J.A.Hurlbut // Journal of AOAC International. — 2005. — Vol.88, N 4. — PP.1155-1159.

4. Определение бензилпенициллина, левомицетина и тетрациклина в пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. / Л.И.Соколова, А.П.Черняев. // Журнал аналитической химии. — 2001. — Т.56, №11, с.1177-1180.

1. Способ определения содержания левомицетина в пищевых продуктах, включающий экстракцию левомицетина из пробы ацетонитрилом, отделение от осадка раствора, содержащего левомицетин, очистку раствора сорбентом-вермикулитом при массовом соотношении 0,1 г сорбента на 1 г жира в пробе, доочистку раствора и концентрирование из него левомицетина при пропускании через сорбент в виде смеси активированного угля и вермикулита при их массовом соотношении 1:1, десорбцию левомицетина при элюировании этанолом, упаривание элюата с последующим растворением охлажденного остатка в подвижной фазе ацетонитрил-вода при их объемном соотношении 70:30, анализ полученного раствора методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии и расчет содержания левомицетина при помощи градуировочного графика.

2. Сорбент для осуществления способа по п.1, содержащий активированный уголь и вермикулит при их массовом соотношении, равном 1:1.

источник

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано для определения антибиотика в биосистемах (кровь, моча и др.) в фармакокинетических исследованиях, в токсикологическом и техническом анализе лекарственных средств, в кормах для животных, а также может служить основой для создания диагностической системы метаболизма антибиотика. Техническим результатом изобретения является повышение экспрессности, чувствительности и селективности определения левомицетина в пищевых продуктах. Сущность изобретения: левомицетин переводят из пробы в раствор, проводят кислотный гидролиз и осаждают белок из гидролизата с последующим вольтамперометрическим определением левомицетина в безбелковом гидролизате путем регистрации катодных пиков антибиотика на индикаторном ртутно-пленочном или стеклоуглеродном электродах в дифференциальном режиме съемки вольтамперограмм при соответствующих потенциалах -(0,67 0,05)В и -(0,60 0,03)В относительно насыщенного хлорид серебряного электрода на фонах 0,1 моль/дм 3 С₆Н₁₄О₇N₂ (рН 4,7 — 5,1) или 0,1 моль/дм 3 (NH₄)₂SO₄ с добавлением HCl до рН 5,1 при скорости развертки потенциала 10 — 25 мВ/с. Концентрацию левомицетина определяют по высоте пика методом добавок аттестованных смесей. 2 табл.

Изобретение относится к области аналитической химии, в частности к инверсионному вольтамперометрическому способу определения антибиотика (АБ) левомицетина (хлорамфеникола), который представляет собой D (-)-трео-2-Дихлорацетиламино-1-(4-нитрофенил)пропан-1,3-диол Левомицетин относится к антибактериальным веществам и обладает высокой клинической эффективностью в лечении ряда тяжелых инфекций. Его применяют в ветеринарии и животноводстве в качестве лечебно-профилактических средств. АБ добавляются, как правило, в корм на уровне 50-200 г на 1 т. Левомицетин способен переходить в мясо, молоко животных, яйца птиц, другие продукты и оказывать токсическое действие на организм человека при концентрации более 25 мкг/см 3 [Позняковский В. М. Гигиенические основы питания и экспертизы продовольственных товаров. — Новосибирск: Изд-во Новосиб. ун-та, 1996. — 432 с.], что делает потенциально опасным его бесконтрольное применение.

Медико-биологические требования и санитарные нормы качества продовольственного сырья и пищевых продуктов указывают на недопустимость в продуктах питания остаточных количеств левомицетина. Максимальный уровень остатков АБ составляет 0,01 ЕД/г, что соответствует 0,01 мг/кг или 10,0 мкг/кг (предельно допустимая концентрация, ПДК) [Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов — Санитарные правила и нормы СанПиН 2.3.2.560-96.]. Это в свою очередь предъявляет повышенные требования к контролю за качеством пищевого сырья и совершенствованию методов определения АБ.

Наиболее широкое применение как в научных исследованиях, так и в практических учреждениях нашли микробиологические методы [Методические указания по определению остаточных количеств антибиотиков в продуктах животноводства. Мин. здравоохранения СССР. — Москва, 1985 г.], позволяющие определять минимальные концентрации антибиотиков в исследуемом материале. Они основаны на непосредственном биологическом действии АБ на чувствительные штаммы микроорганизмов и являются сравнительно простыми, однако, отличаются недостаточной специфичностью и воспроизводимостью. Методики с их использованием чрезвычайно длительны (время анализа составляет более 36 часов), трудоемки и зачастую применяются лишь для качественного определения АБ.

Практически отсутствуют инструментальные методы определения левомицетина в пищевых продуктах. Известен способ [Меламед Д.Б., Кирпичная В.К., Ляпков Б. Г. Способ анализа левомицетина в пищевых продуктах. А.С. SU 1702302 А1, G 01 N 30/90, А 23 L 3/00] высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в системе растворителей ацетонитрил-вода-дециламин. Для увеличения чувствительности используют ультрафиолетовое детектирование при = 278 нм. Количественное определение левомицетина проводят сравнением площадей пиков левомицетина — стандарта и левомицетина в образце. Несмотря на высокую чувствительность метода ВЭЖХ (10 мкг/кг), длительность анализа с учетом времени пробоподготовки, а также высокая стоимость приборов, существенно ограничивают его использование в контроле пищевых продуктов.

Имеется множество вариантов оптических методов определения левомицетина в лекарственных формах [Таблетки левомицетина. ФС 42-3679-98. — с.8.; Раствор левомицетина. ФС 42-3425-97. — с.6.; Тираспольская С.Г., Степанюк С.Н., Филипьева К. Н. Фотометрическое определение левомицетина в лекарственных формах. //Фармация,-1980.-Т.29, 6, с.48-49].

Согласно литературным данным, левомицетин поглощает в ультрафиолетовой области от 205 до 400 нм. Максимум светопоглощения находится при 278-280 нм.

Значительное место занимают колориметрические методы, основанные на различных специфических цветных реакциях [Тираспольская С.Г., Степанюк С.Н., Филипьева К. Н. Фотометрическое определение левомицетина в лекарственных формах. //Фармация. -1980.-т.29, 6, с.48-49]. Чувствительность этих методов невысока и составляет 0,1 мг/см 3 и более.

Разработан метод иммуноферментного анализа хлорамфеникола в сыворотке крови человека [Колосова А. Ю., Самсонова Ж.В., Блинцов А.Н., Егоров А.М. Твердофазный иммуноферментный анализ хлорамфеникола в сыворотке крови человека. //Вопросы медиц. Химии. — 1998. — т.44., 2, с.194 — 202], основанный на измерении оптической плотности продукта ферментативной реакции в растворе антибиотика в диапазоне концентраций 101000 нг/см 3 . В работе использовано большое количество малодоступных биохимических реагентов. Методика требует больших трудозатрат.

Много внимания в литературе уделено разработке полярографического метода определения левомицетина в фармацевтических препаратах (таблетках, капсулах, глазных каплях, инъекционных растворах и технических порошках) [Мискиджьян С. П. , Кравченюк Л.П. Полярография лекарственных препаратов. — Киев: Изд-во «Вища школа», 1976. — 230 с.]. Полярографическая деполяризация левомицетина основана на восстановлении нитрогрупп и остатка дихлорацетила на ртутном капающем электроде (р.к.э.). Левомицетин образовывал две волны, первая из которых имела потенциал полуволны E_1/2=-0,35 В и соответствовала четырехэлектронному процессу необратимого восстановления нитрогруппы до гидроксиламина. _1/2=-1,10 В. Для подавления максимумов использовали тимол или желатин. Наиболее воспроизводимые результаты количественного определения левомицетина на р. к. э. в чистом препарате получены с использованием желатина [Пассет Б. В. , Антипов М.А. Практикум по техническому анализу и контролю производства химико-фармацевтических препаратов и антибиотиков. — М. : «Медицина», 1981. — 272 с.] (прототип). Сущность методики состоит в растворении 0,1 г препарата в 100 мл 95% спирта. Из полученного раствора отбирали 1 см 3 , добавляли ацетатного буферного фонового раствора до объема 10 см 3 и 1 каплю 1% раствора желатина. После пропускания водорода снимали полярограмму, начиная с 0,0 В. Потенциал полуволны регистрировали при E_1/2=-0,34 В. Аналогично готовили раствор стандартного образца левомицетина и в тех же условиях снимали его полярограмму. Минимально определяемая концентрация составляет 1000 мг/кг. В данных условиях экспрессное количественное определение левомицетина на уровне требований, определяемых нормативными документами (0,01 мг/кг), невозможно.

Одним из ограничивающих факторов применения полярографии (с точки зрения техники безопасности) является также использование больших количеств токсичной ртути в качестве электродов в электролитической ячейке. Поэтому встает задача замены р.к.э. на более безопасные. Таким образом, несмотря на возможность количественного определения левомицетина, ни один из перечисленных выше полярографических методов не применяется в анализе пищевых продуктов.

Одним из наиболее перспективных методов определения АБ, на наш взгляд, является вольтамперометрический (ВА) и в первую очередь такие его высокочувствительные варианты, как дифференциальная вольтамперометрия (ДВА). Преимущество ВА благодаря высокой чувствительности состоит в возможности работы с малыми по массе и объемам пробами в мутных и окрашенных средах. Пробоподготовка может быть существенно упрощена из-за необязательной дополнительной очистки определяемого вещества перед собственно электрохимическим анализом. Поэтому часто допустимы более простые методики предварительного выделения соединений из сложной многокомпонентной системы. Методы вольтамперометрии также ранее не применялись для КХА левомицетина в пищевых продуктах. Это, по-видимому, объясняется отставанием электроаналитической практики пищевых продуктов и недостатком аппаратурного оснащения лабораторий этой отрасли.

Задачей заявляемого изобретения является повышение чувствительности, экспрессности и селективности определения левомицетина в пищевых продуктах методом дифференциальной вольтамперометрии.

Поставленная задача достигается тем, что левомицетин переводят из пробы в раствор, проводят кислотный гидролиз и осаждают белок из гидролизата с последующим вольтамперометрическим определением антибиотика. Новым в способе является то, что проводят кислотный гидролиз 0,10-0,12 моль/дм 3 НСl при температуре 25-30 o С в течение 10-15 минут, затем проводят осаждение водорастворимого белка 2,5-3,0 г сульфатом аммония и 3,0-5,0 см 3 этанолом, отделение осадка центрифугированием в течение 10-15 минут при скорости вращения 6000 об/мин с последующим адсорбционным вольтамперометрическим определением левомицетина в безбелковом гидролизате путем регистрации катодных пиков антибиотика на индикаторном ртутно-пленочном (РПЭ) или стеклоуглеродном (СУ) электродах в дифференциальном режиме съемки вольтамперограмм при соответствующих потенциалах -(0,670,05) В и -(0,600,03) В относительно насыщенного хлорид серебряного электрода (нас. х.с.э.) на фонах 0,1 моль/дм 3 аммония лимоннокислого двузамещенного С₆Н₁₄O₇N₂ (рН 4,7-5,1) или 0,1 моль/дм 3 (NH₄)₂SO₄ с добавлением НCl до рН 5,1 при скорости развертки потенциала 10-25 мВ/с.

В прототипе описано использование в качестве фонов ацетатного буферного раствора (рН 4,4). Определение левомицетина в этих условиях па уровне 10 мкг/кг затруднено из-за плохой воспроизводимости и искажения формы аналитического сигнала, связанных с большим остаточным током, и регистрации дополнительного пика при потенциале Е_п=-(0,480,05) В. Предполагаемый в заявляемом изобретении фон 0,1 моль/дм 3 C₆H₁₄O₇N₂ (рН 4,7-5,1) позволяет определять левомицетин на уровне 2,8-30,0 мкг/кг с хорошей воспроизводимостью. Относительное стандартное отклонение для указанного диапазона концентраций изменяется от 0,20 до 0,08. Абсолютной новизной являются экспериментально подобранные фоны: смесь (NH₄)₂SO₄ с НСl (рН 5,1); 0,1 моль/дм 3 C₆H₁₄O₇N₂, установленный pHl раствора 4,7-5,1, от чего зависит количественное определение левомицетина. Фоновые электролиты (NH₄)SO₄ и C₆H₁₄O₇N₂ одновременно являются хорошими осадителями белковых примесей в пищевых продуктах. Для количественного определения левомицетина они ранее не применялись. Особое значение при вольтамперометрическом анализе левомицетина имеет рН среды. Оптимальным показателем является экспериментально установленное значение рН 4,7-5,1, которое соответствует изоэлектрическому состоянию молекул белков молочных и мясных продуктов. При значении рН 4,7-5,1 растворимость белковых примесей снижена и молекулы белков не перемещаются под воздействием внешнего электрического поля, что способствует стабилизации остаточных белковых примесей и получению хорошо воспроизводимых пиков восстановления левомицетина, особенно при использовании СУ индикаторного электрода. При значении рН 4,7-5,1 регистрируется один четко выраженный пик с потенциалом -(0,670,05) и -(0,600,03) В соответственно на РПЭ и СУ электродах. При 5,1 0,17 при определении левомицетина на уровне 10 мкг/кг).

Еще одним отличительным признаком является использование РПЭ или СУ электродов в качестве индикаторных. Ртутно-пленочный представляет собой пленку ртути толщиной 20-50 мкм, нанесенную на серебряную подложку, площадь поверхности составляет 15,0 мм 2 , рабочая поверхность стеклоуглеродного электрода составляет 25-30 мм 2 (в прототипе применяли ртутный капающий электрод, р.к. э.). Существенным преимуществом РПЭ является возможность получения более узких и высоких пиков, служащих аналитической характеристикой определяемого вещества, за счет значительного возрастания отношения активной поверхности к объему ртути и уменьшения времени выхода определяемого вещества из тонкой пленки (в два — три раза по сравнению с р.к.э.). Использование СУ электрода обусловлено высокой химической и электрохимической устойчивостью графита, широкой областью рабочих потенциалов как в водных, так и в неводных средах, а также простотой механического обновления поверхности. Величина потенциала восстановления левомицетина определяется строением, структурой и степенью адсорбируемости на гексагонах графита. По легкости восстановления РПЭ и СУ электроды можно расположить: РПЭ -(0,670,05) В СУ -(0,600,03) В Структурное подобие материала электрода и специфическая адсорбция, по-видимому, благоприятствуют более обратимому восстановлению левомицетина на СУ электроде, чем на РПЭ. Нижняя граница определяемых содержаний левомицетина при использовании РПЭ и СУ электродов на 2-3 порядка ниже, чем на р.к. э. , и составляет 2,8 и 3,4 мкг/кг соответственно. Пики, полученные с использованием таких электродов, характеризуются хорошей воспроизводимостью, кроме того, РПЭ является менее токсичным, чем р.к.э., а СУ — не токсичным. Оба электрода удобны в практической работе. Для определения левомицетина РПЭ и СУ ранее не применялись.

Использование дифференциального режима записи вольтамперограмм позволяет фиксировать четкие узкие пики, что повышает разрешающую способность способа и облегчает автоматизацию электродного процесса. Для определения левомицетина дифференциальный режим ранее не применялся.

В предлагаемом способе установлены условия подготовки пробы молочных продуктов, яиц, мяса и субпродуктов убойных животных и птиц. Составные компоненты растворимых белков пищевых продуктов адсорбируются на углеродных и ртутных электродах и участвуют в редокс превращениях. На поверхности электрода может образовываться слой белка толщиной Возможны также конформационные изменения белковых макромолекул на поверхности [Тарасович М.Р., Радюшкина К. А. , Богдановская В.А. Электрохимия порфиринов. — М.: Наука, 1991. — 312 с.]. Поэтому присутствие белков затрудняет электродные процессы, снижает чувствительность, воспроизводимость и точность анализа. Для отделения белка и его распада на более простые составные части использовали кислотный гидролиз 0,10-0,12 моль/дм 3 НС1 при температуре 25-30 o С в течение 10-15 минут при перемешивании или встряхивании (при анализе мясных продуктов). (В прототипе гидролиз не применяли). Концентрация кислоты, время гидролиза (10-15 минут) и температура (25-30 o С) подобраны экспериментально. Использование НСl с молярной концентрацией с 3 ухудшает условия гидролиза, а при с > 0,15 моль/дм 3 ухудшаются условия электрохимического определения из-за большого значения остаточного тока, связанного с выделением водорода на индикаторных электродах. Оптимальное время гидролиза (_г): 10-15 минут. При _г>15 мин снижается экспресспость анализа, а при _г o С. При t_г o C усиливаются процессы соосаждения антибиотика с нерастворимыми белками, а при t_г>30 o C снижается устойчивость левомицетина в растворе, что приводит к уменьшению высоты пика и снижению точности определения.

Отличительным признаком являются также установленные условия осаждения остаточных количеств растворимого белка из гидролизата (в прототипе осаждение не применяли). В предлагаемом способе в качестве осадителя выбрана соль аммония сернокислого (NH₄)₂SO₄ в количестве 2,5-3,0 г с добавлением 3,0-5,0 см 3 этанола. Использование больших количеств соли (более 3,0 г) и спирта (более 5,0 см 3 ) повышает растворимость белковых примесей и ухудшает условия проведения собственно электрохимической реакции на индикаторном электроде. При добавлении соли менее 2,5 г и объема спирта менее 3,0 см 3 ухудшаются условия осаждения. Осадок белка может вновь частично раствориться при стоянии пробы или после разведения пробы водой или раствором фонового электролита. Соль и спирт добавляют в гидролизат, рН которого лежит в диапазоне 4,7-5,1, что соответствует изоэлектрической точке остаточных количеств растворимых белковых примесей. При этих значениях рН растворимость белков снижена. При 5,1 3 вносят 25,0 см 2 молока (или молочного продукта, взвешенного с точностью до 0,01 г) и 25,0 см 2 0,1 моль/дм 3 HСl. Смесь энергично встряхивают в течение 10 минут. Затем к смеси добавляют 2,5-3,0 г (NH₄)₂SO₄ и 3,0-5,0 см 3 этанола. Снова энергично встряхивают содержимое колбы в течение 5 минут. Полученную смесь переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют 10 минут при скорости 6000 об/мин. Центрифугат отфильтровывают через бумажный фильтр в коническую колбу вместимостью 100,0 см 3 , добавляют С₆Н₁₄О₇N₂ до рH 4-5 и перемешивают до полного растворения. Аликвоту фильтрата объемом 10,0 см 3 помещают в электролизер и проводят вольтамперометрические измерения при условиях: потенциал электролиза Е_э=-0,45 В, время электролиза _э = 30 c, скорость развертки потенциала w= 10 мВ/с. Катодный пик левомицетина регистрируют с использованием ртутно-пленочного электрода в диапазоне потенциалов -(0,670,05) В или стеклоуглеродного индикаторного электрода в диапазоне потенциалов -(0,600,03) В при чувствительности прибора 110 -9 — 510 -10 А/мм в дифференциальном режиме съемки вольтамперограмм. Содержание антибиотика оценивают методом добавок аттестованных смесей. Время анализа одной пробы не превышает 60 минут.

Пример 2. Определение левомицетина (хлорамфеникола) в мясе и субпродуктах убойных животных.

В коническую колбу вместимостью 100,0 см 3 вносят 5,0-10,0 г мелко измельченного мяса, взвешенного с точностью до 0,01 г, добавляют 20,0 см 2 0,1 моль/дм 3 НСl и 5,0 см 3 этилового спирта. Смесь встряхивают в течение 10-15 минут, переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют 15 минут при скорости вращения 6000 об/мин. Центрифугат отфильтровывают через бумажный фильтр в коническую колбу вместимостью 100,0 см 3 и добавляют 3,0 г (NH₄)₂SO₄. Содержимое колбы встряхивают в течение 10-15 минут. Полученную смесь переносят в центрифужные пробирки и вновь центрифугируют 15 минут при скорости вращения 6000 об/мин. Центрифугат отфильтровывают через бумажный фильтр в коническую колбу вместимостью 50,0 см 3 . Для анализа берут аликвоту полученного фильтрата объемом 1,0-5,0 см 3 , вносят в кварцевый стакан вместимостью 15,0-25,0 см 3 с помощью пипетки и доводят бидистиллированной водой до объема 10,0 см 3 . Затем проводят вольтамперометрические измерения при условиях: потенциал электролиза Е_э= -0,45 В, время электролиза _э = 30 c, скорость развертки потенциала w=20 мВ/с. Катодный пик левомицетина регистрируют в диапазоне потенциалов -(0,670,05) В или -(0,600,03) В соответственно на ртутно-пленочном или стеклоуглеродном электродах при чувствительности прибора 110 -9 — 510 -10 А/мм в дифференциальном режиме съемки вольтамперограмм. Содержание антибиотика оценивают методом добавок аттестованных смесей. Время анализа одной пробы не превышает 60-80 минут.

Пример 3. Определение левомицетина (хлорамфеникола) в яйце птицы.

В коническую колбу вместимостью 100,0 см 3 вносят 5,0-10,0 г предварительно взбитого до однородной массы яйца, взвешенного с точностью до 0,01 г, добавляют 5,0 см 3 этанола и 20,0 см 3 0,1 моль/дм 3 НСl. Смесь осторожно перемешивают покачиванием в течение 10-15 минут, переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 15 минут при скорости вращения 6000 об/мин. Центрифугат осторожно сливают в колбу вместимостью 50,0 см 3 , добавляют 3,0 г (NH₄)₂SO₄ маленькими порциями до полного растворения соли, пока не образуется яичный студень. Полученный студень энергично встряхивают до образования однородного жидкого раствора, переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 15 минут при скорости вращения 6000 об/мин. Центрифугат отфильтровывают через бумажный фильтр в коническую колбу вместимостью 50,0 см 3 . Для анализа берут аликвоту полученного фильтрата пробы объемом 1,0-5,0 см 3 , вносят в кварцевый стакан вместимостью 15,0-25,0 см 3 с помощью пипетки и доводят бидистиллированной водой до объема 10,0 см 3 . Затем проводят вольтамперометрические измерения при условиях: потенциал электролиза Е_э=-0,45 В, время электролиза _э = 30 c, скорость развертки потенциала w=20 мВ/с. Катодный пик левомицетина регистрируют в диапазоне потенциалов -(0,670,05) В на ртутно-пленочном электроде при чувствительности прибора 110 -9 — 510 -10 А/мм в дифференциальном режиме съемки вольтамперограмм. Содержание антибиотика оценивают методом добавок аттестованных смесей. Время анализа одной пробы не превышает 70 минут.

Пример 4. Определение левомицетина (хлорамфеникола) в глазных каплях и таблетках.

Пробу глазных капель объемом 0,2 см 3 вносят в кварцевый стаканчик вместимостью 15,025,0 см 3 , разводят бидистиллированной водой до 10 см 3 . Для анализа берут аликвоту полученного раствора объемом 0,2 см 3 , вносят в другой полярографически чистый кварцевый стаканчик вместимостью 15,025,0 см 3 и доводят фоновым раствором электролита 0,1 моль/дм 3 (NH₄)₂SO₄ до 10,0 см 3 и проводят вольтамперометрические измерения при условиях: потенциал электролиза Е_э=-0,45 В, время электролиза _э = 30 c, скорость развертки потенциала w= 25 мВ/с. Катодный пик левомицетина регистрируют в диапазоне потенциалов -(0,670,05) В на ртутно-пленочном электроде при чувствительности прибора (1-5)10 -8 А/мм в дифференциальном режиме съемки вольтамперограмм. Содержание антибиотика оценивают методом добавок аттестованных смесей. Время анализа одной пробы не превышает 10 минут.

При анализе таблеток левомицетина измельчают в ступке 5 таблеток, берут навеску пробы 0,09 г, взвешенную с точностью до 0,001 г, вносят в мерную колбу вместимостью 100,0 см 3 , растворяют навеску пробы в 5.0 см 3 этанола и доводят бидистиллированной водой до метки. 0,2 см 3 полученного раствора вносят в кварцевый стаканчик вместимостью 15,0-25,0 см 3 и добавляют бидистиллированную воду до 6,0 см 3 . Для анализа берут аликвоту объемом 0,3 см 3 , доводят фоновым раствором электролита 0,1 моль/дм 3 (NH₄)₂SO₄ до 10,0 см 3 и далее вольтамперометрические измерения проводят согласно описанному выше примеру 4.

По предлагаемому способу проведена метрологическая аттестация способа количественного химического анализа проб пищевых продуктов и лекарственных препаратов на содержание массовых концентраций левомицетина (хлорамфеникола) методом дифференциальной вольтамперометрии.

Метрологическая аттестация проведена с целью установления приписанных характеристик погрешности результатов анализа, а также для назначения нормативов контроля точности. Метрологические исследования и аттестация данного способа проведены аккредитованной метрологической службой научно-исследовательской лаборатории Томского политехнического университета согласно требованиям ГОСТ Р 8.563-96 «Методики выполнения измерений» и МИ 2336-95 «Характеристики погрешности результатов количественного химического анализа. Алгоритмы оценивания».

Характеристика случайной составляющей погрешности (показатель воспроизводимости) оценена по результатам анализов различных объектов. Из каждого объекта проводили анализ 14 проб по две параллельных. При этом варьировали условия проведения анализов (время, приборы, температура, операторы и т.д.), чтобы учесть все возможные влияющие факторы. Характеристика случайной составляющей погрешности в диапазоне определяемых массовых концентраций левомицетина 3,0-30,0 мкг/кг находится в пределах от 7 до 14 отн.%.

Оценку характеристики систематической составляющей погрешности (показатель правильности) проводили по МИ 2336-95 с использованием образцов для контроля и методом добавок определенного вещества в пробу. Образцы для контроля по первому алгоритму готовили из реальных рабочих проб анализируемых объектов, в которых антибиотик отсутствовал, с добавкой в них определяемого вещества. Добавки левомицетина в пробы делались из чистых реактивов, полученных по фармакопейным статьям Минздрава России до стадии пробоподготовки.

Характеристику общей погрешности оценивали по значениям характеристик случайной и систематической составляющей.

Таким образом, сравнение характеристик КХА левомицетина в пищевых продуктах и фармпрепаратах по предлагаемому способу существенно улучшило метрологические характеристики анализа. Значительно повысилась экспрессность. Время проведения анализа фармпрепаратов сократилось в 3 раза, предложенный способ позволяет экспрессно за 1-1,5 часа определять левомицетин в пищевых продуктах. Условия, используемые в прототипе, не позволяют анализировать пищевые продукты.

Предложенный способ прост, не требует больших трудозатрат, большого количества реактивов и может быть применен в любой химической лаборатории, особенно в настоящее время, когда налажен выпуск современных компьютеризированных анализаторов типа СТА, ТА. Предложенный способ может быть использован для определения антибиотика в биосистемах (кровь, моча и др.) в фармакокинетических исследованиях, в токсикологическом и техническом анализе лекарственных средств, в кормах для животных, а также может служить основой для создания диагностической системы метаболизма антибиотика.

Способ количественного определения левомицетина методом дифференциальной вольтамперометрии, заключающийся в том, что левомицетин переводят из пробы в раствор, проводят кислотный гидролиз и осаждают белок из гидролизата с последующим вольтамперометрическим определением, отличающийся тем, что вольтамперометрическое определение левомицетина осуществляют путем регистрации катодных пиков антибиотика на индикаторном ртутно-пленочном или стеклоуглеродном электродах в дифференциальном режиме съемки вольтамперограмм при соответствующих потенциалах -(0,670,05) В и -(0,600,03) В относительно насыщенного хлорид серебряного электрода на фонах 0,1 моль/дм 3 аммония лимоннокислого двузамещенного (рН 4,7-5,1) или 0,1 моль/дм 3 (NH₄)₂SO₄ с добавлением HCl до рН 5,1 при скорости развертки потенциала 10-25 мВ/с и концентрацию левомицетина определяют по высоте пика методом добавок аттестованных смесей.

источник