Левомицетин определение в мясе

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ОБНАРУЖЕНИЮ, ИДЕНТИФИКАЦИИ И ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ЛЕВОМИЦЕТИНА В ПРОДУКТАХ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

Разработаны Институтом питания АМН СССР, кафедрой общей гигиены Белорусского Государственного института усовершенствования врачей Минздрава СССР.

Предназначены для контроля остаточных количеств левомицетина в пищевых продуктах санитарно-эпидемиологическими станциями, а также заводскими и сельскохозяйственными лабораториями.

Среди ряда посторонних веществ, которые могут загрязнять различные пищевые продукты, важное место занимают лекарственные средства. Наиболее часто пищевые продукты загрязняются остатками лекарственных препаратов, применяемых для профилактики и лечения животных и птицы, ускорения их роста, улучшения качества и сохранности кормов и т.п. Номенклатура лекарств, используемых в животноводстве и ветеринарии, постоянно расширяется.

К сильнодействующим лекарственным препаратам, используемым в ветеринарии и животноводстве, относятся антибиотики. Известно большое число антибиотиков, природных и полусинтетических, обладающих различными свойствами, механизмом и спектром действия, распределением в организме животного, характером метаболизма и др.

Широкое применение антибиотиков в ветеринарии и животноводстве создает определенные проблемы с точки зрения гигиены питания, требует проведения соответствующих мероприятий для снижения уровня загрязненности продуктов этими веществами, а также организации контроля за остаточными количествами препаратов в продуктах животноводства.

При систематическом поступлении в организм человека с пищей антибиотики могут вызывать различные аллергические реакции, нарушение обмена веществ, дисбактериоз, подавлять активность некоторых ферментов, изменять микрофлору, способствовать распространению устойчивых форм микроорганизмов и т.д. Следует учитывать возможность отрицательного влияния антибиотиков в сырье для пищевой промышленности на проведение ряда технологических процессов по переработке мяса, рыбы, молока и других продуктов, кроме того, наличие антибиотиков может затруднять бактериологические исследования качества продуктов животного происхождения.

В мясе, печени, почках, молоке, твороге, сметане, сыре, яйце, рыбе, меде и других продуктах довольно часто обнаруживают остаточные количества антибиотиков, что предопределяет необходимость проведения выборочного, периодического или систематического их контроля. Некоторые из перечисленных продуктов являются диетическими (молоко, творог, сметана и др.), поэтому отсутствие в них токсических и лекарственных соединений особенно важно.

В СССР остаточные количества ряда антибиотиков регламентированы предельно допустимыми концентрациями (ПДК) . К ним относятся тетрациклины (0,01 ед./г), пенициллины (0,01 ед./г) и стрептомицин (0,5 ед./г).

Медико-биологические требования и санитарные нормы качества продовольственного сырья и пищевых продуктов. М., Издательство стандартов, 1990 г.

Для контроля уровней этих антибиотиков Минздравом СССР утверждены микробиологические методы определения, которые позволяют обнаруживать и идентифицировать группы указанных веществ на уровне ПДК.

Левомицетин (хлормицетин, хлорамфеникол) — эффективный синтетический антибиотик широкого спектра действия, запрещен к использованию в животноводстве и ветеринарии для лечения скота, птицы, мясо, молоко и яйца которых предназначены для питания людей. Это связано с токсичностью левомицетина, проявляющейся в аллергических реакциях, поражении кроветворных органов и др. Однако относительная дешевизна этого препарата и высокая антибактериальная активность приводят к нелегальному использованию его в относительно высоких масштабах.

Микробиологические методы неэффективны для анализа этого антибиотика в пищевых продуктах, т.к. найденные тест-культуры малочувствительны и не позволяют осуществлять контроль за остаточными количествами левомицетина хотя бы на уровне ПДК других антибиотиков, разрешенных к применению.

В связи с этим за рубежом наиболее часто применяют химические методы определения левомицетина в пищевых продуктах с использованием хроматографического разделения.

В настоящих Методических рекомендациях впервые в СССР предпринята попытка применения для контроля остаточных количеств левомицетина в пищевых продуктах простого химического метода анализа, основанного на извлечении антибиотика экстракцией органическим растворителем, концентрировании экстракта, отделении левомицетина в тонком слое силикагеля от коэкстрактивных веществ и определении его после восстановления в виде производного с n-деметиламинобензальдегидом.

Доступность реактивов и оборудования позволяет рекомендовать этот метод для серийных анализов пищевых продуктов в условиях санэпидстанций, заводских и сельскохозяйственных лабораторий.

Предел обнаружения левомицетина на хроматографической пластинке 5 — 10 нг в зоне. Относительное стандартное отклонение при визуальном определении не превышает 0,4, при спектрофотометрическом — 0,2. Метод позволяет проводить анализ левомицетина при содержании его 0,05 мг/кг продукта и выше.

Метод состоит из следующих основных стадий:

1. Отбор и подготовка пробы.

2. Извлечение левомицетина из пищевых продуктов и концентрированного экстракта.

3. Хроматографическое разделение, идентификация и ориентировочная оценка концентрации левомицетина в экстракте.

4. Подтверждение наличия левомицетина в пробе.

5. Количественное определение и расчет содержания левомицетина в продукте.

Спектрофотометр СФ-26 или аналог

Термостат ТС-80М-2 или аналог

Азот, поверочный нулевой газ

Центрифуга настольная по 375-4261 или аналог

Ротационный испаритель с крышкой по ТУ 25-11-917

Баня масляная или глицериновая

Камера для тонкослойной хроматографии с притертой крышкой, например стеклянный четырехгранный сосуд 195 x 195 x 200 мм завода «Дружная горка».

Пластины для тонкослойной хроматографии «Силуфол» размером 15 x 15 см, ЧСФР или Сорбфил 100 x 100 (г. Краснодар) ТУ 26-11-17-89

Весы технические по ГОСТ 24104

Весы аналитические по ГОСТ 24104

Карандаш графитовый М или аналог

Цилиндры мерные вместимостью 25 и 100 мл по ГОСТ 1770

Колбы плоскодонные на 250 и 500 мл с НШ N 14,5 по ТУ 48-52

Колбы мерные на 25 мл по ГОСТ 1770

Пипетки на 5 и 10 мл по ГОСТ 20292

Колбы для упаривания на мл с НШ N 14,5 по ГОСТ 10394

Микрошприц на 10 и 25 мкл

Натрий сернокислый, безводный по ГОСТ 4166

Серная кислота по ГОСТ 14262 1 н

Натрий хлористый по ГОСТ насыщенный раствор в воде

Натрий углекислый по ГОСТ 2% водный раствор

Ацетонитрил по ТУ 6-09-3534-87

бета-глукуронидаза, водный раствор 1 мг/мл

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709

Кислота соляная, конц. по ГОСТ 3118

Хлорид олова (II), восстанавливающий реактив: 3 мл 15% раствора SnCl

(в воде) + 15 мл HCl + 180 мл H O

Однозамещенный фосфат калия

Двузамещенный фосфат натрия

Способ отбора и подготовки проб должен быть указан в нормативно-технической документации на конкретную продукцию.

Мясо . 10 +/- 0,1 г гомогенизируют с 15 мл 0,025 М фосфатного

буфера, pH 6,88 (0,34 г KH PO и 0,36 г Na HPO растворяют в 100 мл

дистиллированной воды), добавляли 200 мкл водного раствора

бета-глукуронидазы и инкубировали 1,5 часа при 37 °С. Гомогенат

экстрагировали 3 x 30 мл этилацетата, при необходимости применяя для

расслоения суспензии центрифугирование 5 — 10 мин. при 4000 об./мин.

Этилацетатный слой объединяли.

Аналогично извлекали левомицетин из мясных продуктов, органов и

Молоко . 25 +/- 0,1 мл насыщают 10 г Na SO , приливают 10 мл

этилацетата и 5 мл 1 н H SO , интенсивно встряхивают 1 — 2 мин. Для

расслоения эмульсии применяют центрифугирование 5 — 10 мин. при 4000

об./мин. Этилацетат декантируют, а супернатант экстрагируют последовательно

30 и 20 мл этилацетата, при необходимости применяя центрифугирование для

Аналогично извлекали левомицетин из кефира, ряженки, йогуртов.

Яйцо . 10 +/- 0,1 г гомогената яйца перетирают с 5 г Na SO ,

приливают 40 мл этилацетата и 5 мл 1 н H SO , перемешивают и центрифугируют

5 — 10 мин. при 4000 об./мин. Этилацетатный слой декантируют, а водную

часть экстрагируют последовательно 30 и 20 мл этилацетата, при

необходимости применяя центрифугирование для расслоения. Объединенные

этилацетатные экстракты из продуктов промывают последовательно 10 мл 2%

раствора Na CO , насыщенного NaCl, и 10 мл насыщенного раствора NaCl.

Яичный порошок предварительно разводят водой до консистенции

Органический слой отбирают и упаривают на ротационном испарителе при

исчезновения запаха этилацетата, добавляют 3 мл смеси ацетонитрил — вода

1:4 и экстрагируют 3 x 5 мл петролейного эфира. Петролейный эфир

отбрасывают и извлекают левомицетин этилацетатом (3 x 5 мл). Этилацетатный

экстракт сушат над Na SO (1 г), декантируют, промывают 3 мл этилацетата

сульфат натрия, объединяют его с экстрактом и упаривают на ротационном

испарителе при температуре

Отвешивают 25 мг левомицетина, помещают в мерную колбу на 25 мл и растворяют в метаноле, концентрация левомицетина — 1 мг/мл. 0,25 мл полученного раствора помещают в мерную колбу на 25 мл и разбавляют метанолом. Концентрация левомицетина в стандартном растворе 10 нг/мкл.

При анализе сметаны ее разбавляют в 2,5 — 5 раз в зависимости от жирности. Сыры и творог гомогенизируют с водой до получения гомогенной массы.

На пластинку для тонкослойной хроматографии наносят (рис. а — рисунки здесь и далее не приводятся): в точки 1, 3 и 5 соответственно 1, 2 и 4 мкл раствора стандарта, а в точки 2 и 4 соответственно 3 и 10 мкл концентрированного экстракта.

Пластинку помещают в камеру для ТСХ и хроматографируют в системе

растворителей хлороформ — метанол 10:1. По достижении фронтом элюента

верхнего края пластинки ее вынимают, сушат, опрыскивают раствором SnCl в

HCl, оставляют на 15 мин. и опрыскивают раствором

n-диметиламинобензальдегида. Появление желтых пятен на хроматографической

пластинке по оттенку и R , соответствующих пятнам стандарта,

свидетельствует о возможном присутствии левомицетина в продукте. Сравнивая

интенсивность окраски пятен стандартов и опытной пробы, ориентировочно

оценивают содержание левомицетина в экстракте.

4. Подтверждение наличия левомицетина в пробе

Аликвотную часть экстракта (50 — 100 мкл) упаривают досуха, добавляют

150 мкл 10% раствора HCl, греют на масляной бане при температуре 98 °С в

течение 30 мин., отдувают досуха азотом и приливают 200 мкл 2% метанольного

На хроматографическую пластинку наносят 5 — 10 мкл полученной пробы и

соответствующее количество стандарта левомицетина (с учетом предварительной

оценки содержания левомицетина в экстракте); пластинку помещают в камеру

для ТСХ и хроматографируют в системе растворителей хлороформ — метанол —

уксусная кислота — вода 12:5:4:2.

По достижении фронтом элюента верхнего края пластинки ее вынимают,

сушат, опрыскивают раствором SnCl в HCl, оставляют на 15 мин. Вновь

опрыскивают раствором n-диметиламинобензальдегида. Появление желтых пятен

на хроматографической пластинке по оттенку и R , соответствующих пятнам

стандарта, подтверждает наличие левомицетина в продукте.

5. Количественное определение и расчет

содержания левомицетина в продукте

При необходимости точного количественного определения левомицетина в

пищевом продукте на хроматографическую пластинку наносят в несколько точек,

близко расположенных друг к другу, аликвотную часть экстракта и таким же

образом раствор стандарта так, чтобы количество левомицетина в нем было

близко к установленному в пробе при ориентировочной визуальной оценке.

Пластинку хроматографируют и опрыскивают как в п. 3.2. Вырезают зоны

левомицетина в опытной пробе, стандарте и соответствующую по R и площади

зону на пластинке, служащую контролем (рис. б). Зоны элюируют 3 x 1 мл

метанола, метанол упаривают досуха, приливают 200 мкл 5% раствора SnCl в

5% HCl, греют при температуре 98 °С в течение 1 часа; пробы охлаждают,

добавляют по 2 мл 1% раствора n-диметиламинобензальдегида в метаноле, 1 мл

метанола и измеряют оптическую плотность полученных растворов опытной пробы

и стандарта относительно контрольной пробы на спектрофотометре в кюветах с

l = 10 мм при лямбда = 430 нм.

Рассчитывают содержание левомицетина в пробе продукта по формуле:

k — коэффициент, учитывающий полноту извлечения левомицетина из

пищевого продукта и равный 1,33 для мяса, 1,13 — для молока и 1,25 — для

ОП — оптическая плотность элюата опытной пробы, относ. ед.;

ОП — оптическая плотность элюата стандарта, относ. ед.;

P — количество стандарта левомицетина, нанесенного на пластинку, мкг;

V — объем анализируемой пробы, мкл;

V — объем аликвотной части экстракта, взятой для количественного

M — масса образца пищевого продукта, кг (л).

Интервал определяемых масс левомицетина составляет 0,5 — 6,0 мкг.

Вычисления проводят до второго десятичного знака.

За окончательный результат испытаний принимают среднее арифметическое двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает 20%.

Окончательный результат округляют до первого десятичного знака.

В случае обнаружения остаточных количеств левомицетина и подтверждения правильности его идентификации в исследуемых пищевых продуктах вопрос с их реализацией решается согласно «Методическим указаниям по определению остаточных количеств антибиотиков в продуктах животноводства». Москва, Минздрав СССР, ГОЭУ. 1985 г., 34 с.

N 3049-84 от 29 июня 1984 г.

Представленные рекомендации являются первой в СССР попыткой наладить систематический контроль за наличием и уровнями левомицетина в пищевых продуктах. До настоящего времени анализ левомицетина при необходимости выполняли микробиологически. Однако, отсутствие чувствительных тест-культур не позволяет рассчитывать на обнаружение микрограммовых количеств этого антибиотика такими способами. В связи с этим особенно важно создание химического метода контроля остаточных количеств левомицетина, позволяющего с небольшими затратами обнаружить, идентифицировать и количественно определить его содержание. Левомицетин обладает определенной токсичностью и поэтому запрещен к использованию как у нас в стране, так и за рубежом для лечения, например, лактирующих коров или кур-несушек. Анализ литературных данных позволяет сделать заключение, что применение его для лечения сельскохозяйственных животных и птицы — достаточно частое явление, оправданное дешевизной и эффективностью препарата.

Интенсификация сельскохозяйственного производства может стать одной из причин снижения качества пищевых продуктов и, в частности, загрязнения их антибиотиками. Поэтому своевременный и надежный контроль за наличием левомицетина становится важным и актуальным.

Все отмеченное позволяет рекомендовать утвердить разработанные методические рекомендации для внедрения в практику работы учреждений Госсаннадзора. Полученные этим методом материалы целесообразно обобщить для создания общей картины частоты и уровней загрязнения пищевых продуктов БССР левомицетином.

Руководитель отдела гигиены питания

Института питания АМН СССР, профессор

Ассоциация содействует в оказании услуги в продаже лесоматериалов: дрова колотые по выгодным ценам на постоянной основе. Лесопродукция отличного качества.

источник

СТАЙЛАБ предлагает тест-системы для определения левомицетина (хлорамфеникола) в молоке в соответствии с ГОСТ Р 52842-2007 (ИСО 18330:2003), сухом молоке, масле, сыре, твороге, молочных продуках (кефире, сметане, йогурте, йогурте с фруктами), меде, пчелином маточном молочке, креветках, рыбной муке, мясе, яйцах по МУК 4.1.3535-18, сыворотке крови/плазме, моче, комбикормах, ферментах, вине и виноградном соке.

Иммунохроматографический метод анализа, тест-полоски

9268 Сухое молоко с содержанием хлорамфеникола 0,13 мкг/кг, 17 мл

9267 Сухое молоко с содержанием хлорамфеникола 0,34 мкг/кг, 17 мл

9269 Сухое молоко с содержанием хлорамфеникола менее 0,015 мкг/кг, 17 мл, для отрицательного контроля

S-4032 cтандарт хлорамфеникола SPEX

Чистые вещества и стандарты сульфаниламидов, нитроимидазолов, пенициллинов, амфениколов для анализа в соответствии с ГОСТ 54904-2012

Левомицетин (хлорамфеникол, хлоромицетин) – это антибиотик широкого спектра действия. Он обладает бактериостатическим действием и эффективен против возбудителей таких заболеваний, как дизентерия, брюшной тиф, пневмония, газовая гангрена, сибирская язва бактерий рода Yersinia (возбудители иерсиниоза, псевдотуберкулеза и чумы) и многих других опасных микроорганизмов. Хлорамфеникол очень хорошо растворяется в жирах и в значительных количествах выделяется с молоком. Его молекула имеет небольшие размеры, и это, вместе с жирорастворимостью, позволяет ему легко проникать во все ткани тела, в том числе, в мозг.

ВОЗ рекомендует использовать масляную суспензию хлорамфеникола в качестве первой линии терапии менингита в странах с низким уровнем дохода. В форме мазей для наружного использования он применяется при фурункулезе и других кожных заболеваниях, а также при ранениях. Многие лечат с помощью левомицетина пищевые токсикоинфекции («пищевые отравления»). Согласно источникам, хлорамфеникол проявляет активность в отношении некоторых крупных вирусов. При этом микроорганизмы очень медленно вырабатывают резистентность к нему, потому левомицетин остается очень эффективным антибиотиком.

В сельском хозяйстве и ветеринарии левомицетин применяется для лечения животных и птицы, больных желудочно-кишечными заболеваниями, в том числе, кокцидиозом, который вызывают паразиты. Также его используют для лечения заболеваний дыхательных путей.

Впервые хлорамфеникол выделили в 1947 году из культуры почвенного микроорганизма Streptomyces venezuelae. В клинической практике он используется с 1949 года. Позднее левомицетин научились синтезировать искусственным путем, и в настоящее время его получают именно таким способом.

В России хлорамфеникол входит в список жизненно необходимых и важнейших лекарственных препаратов и применяется в животноводстве и ветеринарии. В США левомицетин не выпускается для перорального употребления с 1991 года. В странах Евросоюза использование этого средства в животноводстве запрещено. Рекомендации применять хлорамфеникол только для лечения тяжелых заболеваний, запреты на его использование в животноводстве или необходимость контролировать содержание левомицетина в пищевых продуктах связаны с побочными эффектами этого средства, возникающими при хроническом воздействии на человека. Одним из таких эффектов являются реакции гиперчувствительности вплоть до анафилактического шока. Но чаще они выражаются в крапивнице и других кожных проявлениях, особенно при использовании мазей с левомицетином.

Левомицетин метаболизируется в печени с образованием глюкоронида хлорамфеникола – неактивного соединения. В этом виде он выводится почками. Хлорамфеникол ингибирует активность одного из ферментов печени, участвующего в обмене стероидов и некоторых других соединений, а также в нейтрализации токсичных веществ, что нарушает работу печени. В некоторых случаях левомицетин вызывать почечные кровотечения. Хлорамфеникол долгое время остается в организме животных и в пищевых продуктах, в том числе, в мясе и молоке.

Длительное употребление левомицетина в высоких дозировках может вызывать желудочно-кишечные расстройства, раздражение слизистых оболочек рта и желудочно-кишечного тракта, а также возникновение язв на них. Кроме того, он подавляет микрофлору кишечника, что часто приводит к расстройствам пищеварения или вторичной грибковой инфекции.

Самые опасные эффекты хронического употребления левомицетина связаны с его воздействием на кроветворную систему. Он вызывает апластическую анемию (атрофию кроветворения): неизлечимое заболевание, вызванное повреждением клеток костного мозга. При ней снижается количество всех трех типов клеток крови: лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов. Это редкое осложнение, и при употреблении левомицетина оно чаще всего возникает, если это средство применяли перорально. К другим осложнениям со стороны кроветворной системы относится подавление работы костного мозга, а также лейкемия («рак крови»). Чаще всего такая реакция возникает у детей, причем риск ее возникновения увеличивается с увеличением длительности употребления левомицетина.

Дозы левомицетина, способные вызывать побочные эффекты, в том числе, апластическую анемию, до сих пор не определены. Поэтому в странах Евросоюза использование левомицетина при производстве пищевых продуктов животного происхождения запрещено. Минимальный предел чувствительности методов анализа, с помощью которых в Евросоюзе допускается проводить определение левомицетина (хлорамфеникола) в пище составляет 0,3 мкг/кг.

Согласно гигиеническим требованиям к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, принятым в Российской Федерации и странах Таможенного Союза, в соответствии с Техническим Регламентом Таможенного Союза ТР ТС 021/2011 («О безопасности пищевой продукции») содержание левомицетина (хлорамфеникола) в яйцах, мясе и других продуктов не допускается (должно быть менее 0,01 мг/кг, или 10 мкг/кг). Такие же нормы установлены для молочных продуктов Техническим Регламентом Таможенного Союза ТР ТС 033/2013 «О безопасности молока и молочной продукции». С 1 июля 2015 года, согласно ТР ТС 033/2013, максимально допустимое содержание левомицетина в молоке не должно превышать 0,0003 мг/кг (0,3 мкг/кг), что соответствует также нормам Евросоюза. С актуальными законодательными нормативами можно ознакомиться на сайте compact24.com.

Остаточные количества левомицетина (хлорамфеникола) в пищевых продуктах можно определять методами радиоиммуного анализа и жидкостной хроматографии высокого давления. Однако данные методы реализуются на дорогостоящем оборудовании и занимают длительное время. Кроме того, радиоиммунный метод анализа предполагает использование радиоактивных материалов, а хроматографические методы требуют квалифицированного обслуживания и трудоемки. Микробиологические методы определения антибиотиков, в том числе, левомицетина, просты и дешевы, но недостаточно специфичны, поскольку многие микроорганизмы чувствительны к различным антибиотикам.

Для скрининга и в рутинной лабораторной практике широко применяют иммуноферментный метод анализа. Например, с сентября 1998 г. в Германии ИФА является официальным методом скрининга остатков левомицетина в молоке; см.§ 35 LMBG, 01.00 68. В Белоруссии утверждены МУК 10-1-5/118/В от 18.08.2003 по контролю левомицетина в молоке, сухом молоке, яйцах и мясе с помощью тест-системы RIDASCREEN® Chloramphenicol. В России метод иммуноферментного анализа для определения левомицетина в пищевых продуктах утвержден МУК 4.1.1912-04.

источник

4.3. Требования техники безопасности при проведении испытаний

Помещение, в котором проводится определение хлорамфеникола, должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Все операции анализа необходимо проводить в вытяжном шкафу с использованием индивидуальных средств защиты.

4.4. Подготовка к испытанию

4.4.1. Приготовление растворов

Взвешивают 25 мг левомицетина, помещают в мерную колбу на 25 см и растворяют в метаноле, концентрация левомицетина 1 мг/мл. В мерную колбу на 25 см помещают 0,25 см полученного раствора и разбавляют метанолом до метки. Концентрация левомицетина в стандартном растворе 10 нг/мкл.

4.5. Проведение испытания методом ВЭЖХ

4.5.1. Подготовка образца для определения левомицетина в молоке

Смешивают 25 см молока с 12 г безводного сульфата натрия и экстрагируют (3 раза по 15 см этилацетата). Полученную смесь центрифугируют 15 мин со скоростью 4000 об./мин и декантируют. Этилацетатный слой промывают последовательно 5 см насыщенного раствора NaCl с добавлением в него 0,2 см 10% NaOH; 5 см насыщенного раствора NaCl с добавлением 0,2 см 10% СНСООН; 5 см насыщенного раствора NaCl. Органический слой отбирают и упаривают на ротационном испарителе (при 50 °С) до возможно минимального объема, отдувают азотом до исчезновения запаха органических растворителей, добавляют 3 см смеси ацетонитрил-вода (1:4) и экстрагируют 3 раза по 5 см петролейным эфиром. Петролейный эфир отбрасывают и извлекают левомицетин экстракцией этилацетатом (3 раза по 5 см). Этилацетатный слой упаривают досуха, растворяют в 0,1 см метанола.

4.5.2. Подготовка образца для определения левомицетина в мясе

Гомогенизируют 10 г мяса с 15 см фосфатного буфера (0,025 М KНРО + 0,025 М NaHPO) pH=6,88 и экстрагируют 3 раза по 30 см этилацетата. Полученную взвесь центрифугируют 15 мин при 4000 об./мин и декантиуют этилацетатный слой, промывают последовательно 5 см насыщенного раствора NaCl с добавлением 0,2 мл 10%-ного NaOH; 5 мл насыщенного раствора NaCl с добавлением 0,2 мл 10%-ного СНСООН и 5 см насыщенного раствора NaCl. Органический слой отбирают и упаривают на ротационном испарителе (при 50 °С) до возможно минимального объема, отдувают азотом до исчезновения запаха органических растворителей, добавляют 3 см смеси ацетонитрил-вода (1:4) и экстрагируют 3 раза по 5 см петролейного эфира, петролейный эфир отбрасывают и извлекают левомицетин экстракцией этилацетатом (3 раза по 5 см). Этилацетатный слой упаривают досуха, растворяют в 0,1 см метанола.

4.5.3. Подготовка образца для определения левомицетина в яйцах

Перетирают 10 г гомогената яйца с 5 г NaSO приливают 40 см этилацетата и 5 см 1Н HSO перемешивают и центрифугируют 5-10 мин при 4000 об./мин, этилацетатный слой декантируют, водную часть экстрагируют последовательно 30 и 20 см этилацетата, при необходимости применяя центрифугирование для расслоения. Объединенные этилацетатные слои промывают последовательно 10 см 2-процентного раствора NaCO насыщенного NaCl; 10 см насыщенного раствором NaCl.

4.6. Условия хроматографирования (ВЭЖХ)

В жидкостной хроматограф с колонкой (Ультрасфер ODS, С) 5 мкм (250х4,6 мм), УФ детектором при =278 нм, используя элюент ацетонитрил-вода-дециламин (40:60:0,1), вводят 5 мкл стандартного раствора (10 нг/мкл) левомицетина. В тех же условиях вводят метанольный экстракт образца (молока, мяса, яиц).

4.7. Подтверждение наличия левомицетина в образцах

Для подтверждения наличия левомицетина к 50 мкл метанольного экстракта приливают 50 мкл 10%-ного раствора KОН и нагревают 20 мин при 70 °С, 10 мкл полученного раствора вводят в тех же условиях в колонку жидкостного хроматографа. На полученной хроматограмме пик с временем удерживания левомицетина отсутствует. Это подтверждает наличие левомицетина в образце.

4.8.1. За окончательный результат измерения принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. Окончательный результат округляют до второго десятичного знака.

Метрологические характеристики метода определения хлорамфеникола
в продуктах питания животного происхождения (молоке, мясе, яйцах)

источник

ОТРАБОТКА УСЛОВИЙ ПРОБОПОДГОТОВКИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛЕВОМИЦЕТИНА В МЯСНЫХ ПРОДУКТАХ

Уланова Татьяна Сергеевна

д-р биол. наук, профессор, заведующий отделом химико-аналитических методов исследования ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения», РФ, г. Пермь

Карнажицкая Татьяна Дмитриевна

канд. биол. наук, заведующий лабораторией методов жидкостной хроматографии ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения», РФ, г. Пермь

Антипьева Марина Владимировна

канд. биол. наук, старший научный сотрудник лаборатории методов жидкостной хроматографии ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения», РФ, г. Пермь

Пшеничникова Екатерина Олеговна

химик лаборатории методов жидкостной хроматографии ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения», РФ, г. Пермь

ANALYSIS OF SAMPLE PREPARATION CONDITIONS FOR DETERMINATION OF CHLORAMPHENICOL IN MEAT PRODUCTS

Tatyana Ulanova

dr.Sci.Biol., professor, head of department of chemical analysis methods of Federal budget scientific institution “Federal scientific centre for medical and preventive health risk management technologies”, Russia Perm

Tatyana Karnazhitskaya

candidate of Biology, head of the laboratory of a liquid chromatography of Federal budget scientific institution “Federal scientific centre for medical and preventive health risk management technologies” Russia Perm

Marina Antipeva

candidate of Biology, senior research associate of laboratory of a liquid chromatography of Federal budget scientific institution “Federal scientific centre for medical and preventive health risk management technologies” Russia Perm

Ekaterina Pshenichnikova

chemist of laboratory of a liquid chromatography of Federal budget scientific institution “Federal scientific centre for medical and preventive health risk management technologies” Russia Perm

В статье представлены результаты исследований по выбору оптимальных условий пробоподготовки для определения левомицетина (хлорамфеникола) в мясе методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Изучена эффективность извлечения хлорамфеникола из мяса методами жидкостной и твердофазной экстракции. Установлено, что максимальная степень извлечения составляет 99,98 % и достигнута при использовании в качестве пробоподготовки жидкостной экстракции.

This article describes analysis results of sample preparation conditions for determination of chloramphenicol residue in meat by LC/MS/MS method. Efficiency of extraction of chloramphenicol from meat is studied by methods of liquid and solid-phase extraction. The maximum extent of extraction is about 99,98 %. It is reached by using liquid extraction for sample preparation.

Ключевые слова: хлорамфеникол; мясо; жидкостная экстракция; твердофазная экстракция; высокоэффективная жидкостная хроматография с масс-спектрометрическим детектированием.

Keywords: cloramphenicol; meat; liquid extraction; solid-phase extraction; liquid chromatography mass spectrometry.

Одной из задач современной аналитической химии является разработка селективных и высокочувствительных методик определения контаминантов в продуктах питания с целью оценки их влияния на здоровье населения. К числу загрязнителей пищевой продукции относятся ветеринарные препараты, в частности хлорамфеникол (левомицетин), представитель группы ароматических антибиотиков, широко используемый в ветеринарной практике для борьбы с инфекционными заболеваниями. Хлорамфеникол медленно выводится из организма животных и относительно долго сохраняет активность при хранении продуктов. При употреблении продуктов с остаточным содержанием хлорамфеникола в организме человека вырабатывается резистентность к антибиотику, может развиваться дисбактериоз, аллергические реакции, снижается иммунитет. В соответствии с СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов допустимый уровень остаточного содержания хлорамфеникола в продукции составляет 0,0003 мг/кг.

При разработке методики проведения анализа контаминантов в пищевых продуктах важное место занимает пробоподготовка, целью которой является наиболее полное извлечение следовых количеств аналита и эффективная очистка от компонентов биологической матрицы.

В статье представлены результаты исследований по выбору оптимальных условий пробоподготовки в ходе разработки методики определения левомицетина в мясных продуктах.

Экспериментальные исследования по отработке условий проводились на жидкостном хроматографе Agilent 1200 в сочетании с масс-спектрометрическим детектором с тройным квадруполем LC/MS 6460 Agilent Technologies в отработанных условиях выполнения анализа.

При выборе оптимальных условий подготовки проб к анализу для получения более точных результатов при проведении количественного анализа органических соединений необходимо учитывать влияние матричного эффекта, степень извлечения и погрешность подготовки проб к анализу, так как они могут в значительной степени повлиять на конечные результаты измерений [1]. С этой целью проведено сравнение эффективности экстракции антибиотика из образцов мясного фарша с использованием различных способов пробоподготовки.

В ходе проделанной работы был исследованы 2 варианта пробоподготовки с использованием метода твердофазной экстракции с насыпными сорбентами. Пробоподготовка основана на методе “QuEChERS”, используемом для определения пестицидов и других контаминантов в продуктах питания.

В первом варианте к 10 г мясного фарша, с заданным содержанием левомицетина, добавляли 20 см 3 ацетонитрила и соли, в основном MgSO₄ и NaCl, используемые в качестве высаливателей.

Смесь интенсивно встряхивали, центрифугировали при скорости вращения 3000 об/мин. Надосадочный слой отбирали в чистую пробирку объемом 50 см 3 и чистили путем добавления в пробирку с экстрактом сорбента и соли MgSO₄, интенсивно перемешивали в течение 1 минуты. Смесь центрифугировали в течение 1 мин со скоростью 3000 об/мин, верхний слой переносили в чистую пробирку, высушивали в токе воздуха при нагревании. Сухой остаток перерастворяли в 1 см 3 смеси ацетонитрил:вода (1:1), фильтровали через капроновый фильтр с диаметром пор 0,2 мкм и анализировали аликвоту объемом 10 мм 3 методом ВЭЖХ/МС.

Для расчета степени экстракции использовали характеристики, полученные для основного иона: площадь (S 321->152) и отношение сигнал/шум (SNR 321->152). Степень экстракции левомицетина составила 33 %.

В отличие от 1-го (безводного) варианта, исключающего присутствие воды, во 2-ом варианте экстракция протекала в водной среде. 2г мясного фарша, с заданным содержанием левомицетина, помещали в центрифужную пробирку вместимостью 50 см 3 , к образцу добавляли дистиллированную воду (8—10 см 3 ). Смесь интенсивно встряхивали в течение 1 минуты, добавляли 10 см 3 1 %-го раствора уксусной кислоты в ацетонитриле, интенсивно встряхивали в течение 5 минут, добавляли набор для ТФЭ с насыпным сорбентом для анализа мясных и молочных продуктов, встряхивали в течение 1 минуты и центрифугировали при скорости вращения 4000 об/мин. Надосадочный слой отбирали в чистую пробирку объемом 15 см 3 , содержащую сорбент для очистки экстракта, интенсивно встряхивали в течение 2 минут, центрифугировали при скорости вращения 4000 об/мин. Верхний слой растворителя переносили в новую пробирку, высушивали в токе воздуха при температуре 40 о С, перерастворяли в 0,8 см 3 раствора метанол/вода/0,1 % уксусная кислота. Экстракт фильтровали через капроновый фильтр и анализировали в количестве 10 мм 3 методом ВЭЖХ/МС. Степень экстракции хлорамфеникола из образцов мяса составляет 41,0 %.

Наиболее широко используемым приемом извлечения анализируемых веществ из биологических сред, в том числе продуктов питания, является экстракция [2]. Изучена эффективность извлечения левомицетина из мяса методом жидкостной экстракции с использованием в качестве экстрагента этилацетата. Процедура пробоподготовки заключалась в двойной экстракции 10 г мясного фарша, с заданным содержанием левомицетина, этилацетатом. Объединенные экстракты высушивали в токе воздуха на водяной бане до образования остатка в виде маслянистой капли. К остатку добавляли 2 см 3 метанола, 25 см 3 4 %-ного водного раствора хлорида натрия и 20 см 3 гексана. Содержимое пробирки интенсивно встряхивали и центрифугировали в течение 5 мин со скоростью 3000 об/мин. Верхний (гексановый) слой отбрасывали и проводили повторную очистку гексаном. К оставшемуся раствору добавляли 15 см 3 этилацетата, тщательно перемешивали, центрифугировали со скоростью 3000 об/мин. Верхний слой (слой этилацетата) переносили в чистую пробирку, проводили повторную жидкостную экстракцию этилацетатом. Объединенный экстракт высушивали досуха на водяной бане при температуре 45 о С. Остаток растворяли в 1 см 3 смеси метанол:вода=1:1, фильтровали через капроновый фильтр и анализировали аликвоту объемом 10 мм 3 методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ/МС).

Степень экстракции левомицетина составила 99,98 %. Результаты анализа представлены в таблице 2.

С целью сравнения эффективности извлечения хлорамфеникола из мясных продуктов различными способами дополнительно проведены исследования по определению хлорамфеникола из продуктов животного происхождения согласно действующим методическим указаниям МУК 4.1.1912-04 «Определение остаточных количеств левомицетина (хлорамфеникола, хлормицетина) в продуктах животного происхождения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и иммуноферментного анализа».

10 г мясного фарша, с заданным содержанием левомицетина, гомогенизировали с 15см 3 фосфатного буфера (0,025 М КН₂Р0₄ + 0,025 М Na₂НР0₄) рН = 6,88 и экстрагировали 3 раза по 30 см 3 этилацетата. Полученную взвесь центрифугировали 15 мин при 4000 об./мин и декантировали этилацетатный слой, промывали последовательно 5 см 3 насыщенного раствора NaС1 с добавлением 0,2 мл 10 %-ного NaОН; 5 мл насыщенного раствора NaС1 с добавлением 0,2 мл 10 %-ного СН₃СООН и 5 см 3 насыщенного раствора NaС1. Органический слой отбирали и упаривали на ротационном испарителе (при 50 °С) до возможно минимального объема, отдували азотом до исчезновения запаха органических растворителей, добавляли 3 см 3 смеси ацетонитрил:вода (1:4) и экстрагировали 3 раза 5 см 3 петролейного эфира, петролейный эфир отбрасывали и извлекали хлорамфеникол экстракцией этилацетатом (3 раза по 5 см 3 ). Этилацетатный слой упаривали досуха, растворяли в 0,1 см 3 метанола и анализировали аликвотное количество раствора. Степень экстракции хлорамфеникола из образцов мяса составила 56,4 %.

Результаты исследований по определению эффективности извлечения хлорамфеникола методом жидкостной экстракции, твердофазной экстракции с насыпным сорбентом и по методическим указаниям МУК 4.1.1912-04 приведены в таблице 2.

Сравнение эффективности способов извлечения хлорамфеникола из мясной матрицы

Способ пробоподготовки

Степень извлечения с учетом матричного эффекта, %

источник

ГОСТ Р ИСО 13493-2005 Мясо и мясные продукты. Метод определения содержания хлорамфеникола (левомицетина) с помощью жидкостной хроматографии

Текст ГОСТ Р ИСО 13493-2005 Мясо и мясные продукты. Метод определения содержания хлорамфеникола (левомицетина) с помощью жидкостной хроматографии

ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ISO 13493:1998 Meat and meat products — Determination of chloramphenicol content — Method using liquid chromatography (IDT)

Москва Стандартинформ 2006

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. № 184-ФЗ «О техническом регулировании», а правила применения национальных стандартов Российской Федерации — ГОСТ Р 1.0—2004 «Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения»

1 ПОДГОТОВЛЕН Государственным учреждением «Всероссийский научно-исследовательский институт птицеперерабатывающей промышленности» Российской академии сельскохозяйственных наук (ГУ ВНИИПП Россельхозакадемии) на основе собственно аутентичного перевода, указанного в пункте 4

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК116 «Продукты переработки птицы, яиц и сублимационной сушки»

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 16 декабря 2005 г. № 314-ст

4 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ИСО 13493:1998 «Мясо и мясные продукты. Определение содержания хлорамфеникола. Метод жидкостной хроматографии» (IS013493:1998 «Meat and meat products — Determination of chloramphenicol content — Method using liquid chromatography»). Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного стандарта для приведения в соответствие с ГОСТ Р 1.5—2004 (пункт 3.5).

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочных международных (региональных) стандартов соответствующие им национальные стандарты Российской Федерации, сведения о которых приведены в дополнительном приложении Б

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячно издаваемых информационных указателях «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте национального органа Российской Федерации по стандартизации в сети Интернет

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ МЯСО И МЯСНЫЕ ПРОДУКТЫ

Метод определения содержания хлорамфеникола (левомицетина) с помощью жидкостной хроматографии

Method for determination of chloramphenicol content using liquid chromatography

Настоящий стандарт устанавливает метод определения с помощью жидкостной хроматографии содержания хлорамфеникола в мышечной ткани мяса, включая мясо птицы, где массовая доля хлорамфеникола составляет не менее 6,5 мкг/кг.

Данный метод неприменим к испорченным образцам.

Примечание — Настоящий стандарт допускается применять для определения содержания хлорамфеникола во всех видах мяса и мясопродуктов. Однако межлабораторные испытания по установлению точности метода были проведены только на образцах мышечной ткани.

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ИСО 3100-1:1991 Мясо и мясные продукты. Методы отбора и подготовки образцов. Часть 1. Отбор образцов

ИСО 3696:1987 Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы испытаний

ИСО 5725-1:1994 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения

ИСО 5725-2:1994 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений

В настоящем стандарте применяют следующий термин с соответствующим определением:

3.1 содержание хлорамфеникола в мясе и мясных продуктах: Массовая доля хлорамфеникола, измеренная с помощью метода, установленного в настоящем стандарте.

Примечание — Содержание хлорамфеникола выражают в микрограммах на килограмм.

Хлорамфеникол из пробы экстрагируют водой. Экстракт фильтруют и полученный водный раствор очищают от липофильных компонентов методом твердофазной экстракции. Хлорамфеникол элюируют с экстракционного патрона дихлорметаном. Органический растворитель выпаривают и остаток очищают с помощью жидко-жидкостной экстракции в системе вода-толуол. Хлорамфеникол определяют методом обращенно-фазной хроматографии с детектированием в ультрафиолетовой (УФ) области спектра.

При отсутствии специальных указаний используют реактивы только признанных аналитических марок.

5.1 Вода должна соответствовать требованиям квалификации не ниже 3-й степени чистоты согласно ИСО 3696. Вода не должна содержать органические примеси.

5.2 Азот, пригодный для выпаривания растворителей.

5.5 Ацетатный буфер, с (CH₃CO₂Na) = 0,01 моль/дм 3 , pH = 4,3.

Растворяют 0,82 г безводного ацетата натрия примерно в 970 см 3 воды. С помощью рН-метра (6.1) доводят pH до 4,3 добавлением раствора уксусной кислоты массовой долей 50 %. Переносят раствор в мерную колбу вместимостью 1000 см 3 . Доводят водой до метки и перемешивают.

5.6 Ацетонитрил для УФ спектроскопии.

К 250 см 3 ацетонитрила (5.6) добавляют 750 см 3 ацетатного буфера (5.5) и тщательно перемешивают.

Перед использованием элюент фильтруют через мембранный фильтр 0,22 мкм (6.2) и дегазируют.

5.8 Основной раствор хлорамфеникола массовой концентрации 100 мкг/см 3 .

Взвешивают 10 мг хлорамфеникола с точностью 0,1 мг и переносят навеску в мерную колбу вместимостью 100 см 3 . Добавляют метанол до метки и перемешивают.

Приготовленный основной раствор стабилен в течение 1 мес при хранении в темноте.

5.9 Стандартные растворы хлорамфеникола.

Пипеткой вносят 5,0 см 3 основного раствора (5.8) в мерную колбу вместимостью 100 см 3 . Разбавляют водой до метки и перемешивают. Разбавляют 1,0,2,0,5,0 и 15,0 см 3 этого раствора до 100 см 3 для получения четырех стандартных растворов с массовой концентрацией хлорамфеникола соответственно 0,05; 0,10; 0,25 и 0.75 мкг/см 3 .

Эти стандартные растворы стабильны в течение одной недели при хранении в темноте.

Используют обычное лабораторное оборудование, в частности:

6.2 Мембранный фильтр с малым мертвым объемом и размером пор 0,22 мкм.

6.3 Механическое или электрическое устройство, пригодное для измельчения образца.

В качестве такого устройства может быть использован высокоскоростной ротационный куттер или мясорубка с решеткой, диаметр отверстий которой не превышает 4 мм.

6.4 Лабораторный гомогенизатор (например гомогенизатор типа Стомахер или Вортекс) 1 *.

6.5 Фильтровальная бумага обеззоленная быстрофильтрующая диаметром примерно 15 см.

Примечание — Например, можно использовать Ватман 414

6.6 Экстракционные патроны вместимостью 20 см 3 с диатомитовой землей, которая задерживает липофильные компоненты из водных растворов.

Примечание — Можно использовать, например, картриджи Extrelut® производства фирмы Merck, Дармштадт, Германия (№ 11737) 1 >.

6.7 Водяная баня или нагревательный блок, позволяющие поддерживать температуру (40 ± 1) °C и имеющие устройство для выпаривания потоком азота (5.2), или ротационный вакуумный испаритель.

6.8 Центрифужные пробирки вместимостью 25 см 3 .

6.9 Смеситель для пробирок типа Вортекс, обеспечивающий частоту вращения примерно 700 мин -1 .

6.10 Центрифуга, обеспечивающая радиальное ускорение примерно 1000 д.

6.11 Микропипетки вместимостью 300 мм 3 .

Это примеры коммерчески доступной продукции. Данная информация приведена только для удобства пользователей настоящего стандарта и не является поддержкой этой продукции.

6.12 Жидкостной хроматограф, оборудованный:

— насосом постоянного потока;

— хроматографической колонкой внутренним диаметром 3 мм, длиной 20 см, заполненную обращенной фазой С₈ или С₁₈ с размером частиц 5 мкм, или другой колонкой с эквивалентными характеристиками;

— детектором УФ/ВИД, обеспечивающим измерение при длине волны 285 нм, если возможно — диодно-матричный детектором (используется для подтверждения обнаружения хлорамфеникола);

— самописцем с регулируемым диапазоном измерения или интегратором.

Отбор образцов не является частью метода, изложенного в настоящем стандарте. Рекомендуемый метод отбора образцов приведен в ИСО 3100-1.

Очень важно, чтобы в лабораторию поступали представительные образцы, которые в процессе хранения и транспортирования не были испорчены или изменены.

От представительного образца, поступившего в лабораторию, отбирают для анализа образец массой не менее 200 г. Образец хранят 8 условиях, исключающих его порчу и изменение состава.

Доводят температуру образца до комнатной температуры. Удаляют жировую ткань и несъедобные части образца.

Измельчают образец с помощью устройства (6.3). При этом необходимо следить за тем, чтобы температура образца не превышала 25 °C. При использовании мясорубки образец пропускают через нее не менее двух раз.

Приготовленный образец помещают в герметично закрываемую емкость. Закрывают и хранят так, чтобы не допустить порчи и изменения его состава.

В случае необходимости образец хранят при температуре ниже минус 18 °C.

Анализ образца проводят как можно быстрее, но не позднее 24 ч после измельчения.

Примечание — Для контроля повторяемости результатов (см. 11.2) проводят два параллельных определения в соответствии с 9.1—9.6.

Параллельно с анализом раствора (или серии растворов), полученного из испытуемого образца, проводят анализ раствора, полученного из образца, заведомо не содержащего хлорамфеникол (образец-бланк), и раствора, полученного из образца, в который добавлен хлорамфеникол в количестве 10 мкг/кг (образец-бланк с внесенным хлорамфениколом).

В конической колбе вместимостью 100 см 3 взвешивают 10 г (т) измельченного образца (8) с точностью 0,1 г.

Добавляют 40,0 см 3 воды и энергично перемешивают в течение 3 мин с помощью лабораторного гомогенизатора (6.4).

Общий объем образующейся водной фазы (Vi) равен 40,0 см 3 плюс объем воды, содержащейся в пробе (обычно в 10 г пробы содержится примерно 7,5 см 3 воды).

Гомогенат фильтруют через бумажный фильтр (5).

9.4 Твердофазная экстракция

Переносят 20,0 см 3 фильтрата (У₂) в экстракционный патрон (6.6).

Через (15 ± 2) мин элюируют хлорамфеникол с помощью 70 см 3 дихлорметана (5.3). Выпаривают органическую фазу до объема примерно 1 см 3 на водяной бане (6.7) в слабом потоке азота (5.2) или с помощью ротационного вакуумного испарителя (6.7).

С помощью примерно 10 см 3 дихлорметана (5.3) переносят остаток в центрифужную пробирку (6.8). Осторожно выпаривают досуха.

9.5 Жидко-жидкостная экстракция

К остатку добавляют 400 мм 3 воды (У₃) и 2,0 см 3 толуола (5.4) и перемешивают с умеренной интенсивностью в течение 1 мин на смесителе Вортекс (6.9) с частотой вращения примерно 700 мин -1 .

Центрифугируют в течение 5 мин на центрифуге (6.10) с радиальным ускорением 1000 д.

Пипеткой отбирают как можно больше органической фазы и отбрасывают ее.

Добавляют 1,5 см 3 толуола и перемешивают с умеренной интенсивностью в течение 1 мин на смесителе Вортекс (6.9) с частотой вращения примерно 700 мин -1 .

Центрифугируют в течение 5 мин на центрифуге (6.10) с радиальным ускорением 1000 д. Пипеткой отбирают как можно больше органической фазы и отбрасывают ее.

Микропипеткой (6.11) переносят 300 мм 3 водной фазы в подходящий сосуд.

9.6 Хроматографический анализ

9.6.1 Условия хроматографирования

Скорость бумаги самописца

Объемная скорость потока подвижной фазы (5.7) Объем анализируемого раствора, вводимый (инжектируемый) в хроматограф

от 0,005 до 0,010 единиц оптической плотное ти, что соответствует полной шкале само писца

Примечание — Инжектируемый объем и объемная скорость потока зависят от размеров колонки.

После стабилизации системы жидкостного хроматографа (6.12) инжектируют растворы, полученные из образца-бланка и образца-бланка с внесенным хлорамфениколом, четыре стандартных раствора хлорамфеникола (5.9), раствор, приготовленный из испытуемого образца по 9.5, и снова стандартные растворы хлорамфеникола (5.9).

На хроматограммах образцов проверяют наличие сигнала на участке, соответствующем времени удерживания хлорамфеникола.

Измеряют высоты или площади хроматографических пиков хлорамфеникола для испытуемого раствора и стандартных растворов хлорамфеникола.

Измеренные для стандартных растворов высоты или площади пиков должны линейно зависеть от содержания хлорамфеникола в этих растворах.

Примечание — С помощью диодно-матричного детектора может быть подтверждено обнаружение хлорамфеникола при его содержании в образце более 10 мкг/кг.

Содержание хлорамфеникола w, мкг/кг, в испытуемом образце рассчитывают по формуле

где h — высота или площадь пика в единицах длины или площади, измеренные для испытуемого раствора;

h_s — высота или площадь пика, измеренные для одного из стандартных растворов (5.9);

р — содержание хлорамфеникола в стандартном растворе, мкг/см 3 ;

т — масса испытуемой пробы (9.2), г;

V, — объем водной фазы, полученной после гомогенизации по 9.3, см 3 = 40 см 3 * объем воды в пробе, взятой на испытание);

У₂ — объем фильтрата (V₂ = 20 см 3 ), перенесенного по 9.4 в экстракционный патрон, см 3 ;

У₃ — объем воды (V₃ = 400 мм 3 ), добавленной по 9.5 к сухому остатку, мм 3 .

Результат вычислений округляют до 0,1 мкг/кг.

Результат испытаний нельзя корректировать на открываемость. Открываемость должна быть указана в протоколе испытаний (12).

11.1 Межлабораторные испытания

Точность метода была установлена с помощью межлабораторных испытаний, проведенных в соответствии с ИСО 5725-1 и ИСО 5725-2.

Результаты этой межлабораторной проверки опубликованы в [1]. Результаты этой проверки не могут быть распространены на области концентраций и на матрицы, отличные от указанных в настоящем стандарте.

Результаты другой межлабораторной проверки, приведенной в соответствии с ИСО 5725-1 и ИСО 5725-2, показывают, что открываемость для мяса, мяса птицы и мясных продуктов воспроизводима и равна примерно 55 %.

Абсолютное значение разности результатов двух независимых единичных испытаний, выполненных за короткий промежуток времени одним методом для одного измельченного образца в одной лаборатории одним оператором на одном и том же оборудовании, может превышать 2,1 мкг/кг не более чем в 5 % случаев при содержании хлорамфеникола в образце 10 мкг/кг.

Абсолютное значение разности результатов двух независимых единичных испытаний, выполненных одним методом для идентичного измельченного образца в разных лабораториях разными операторами с использованием разного оборудования, может превышать 4,9 мкг/кг не более чем в 5 % случаев при содержании хлорамфеникола 10 мкг/кг.

В протоколе испытания необходимо указать:

— информацию, необходимую для полной идентификации образца;

— использованный метод отбора образцов (если известен);

— использованный метод испытаний с указанием ссылки на настоящий стандарт;

— условия проведения испытаний, не отраженные в настоящем стандарте или считающиеся неоднозначными, а также все имевшие место случаи, которые могут повлиять на результаты испытаний;

— полученный результат испытаний или два результата испытаний, если проводилась проверка повторяемости;

[1] Aerts M L, Keukens H.J., Werdmuller GA. Liquid Chromatographic Determination of Chloramphenicol Residues in Meat: Interlaboratory Study. J.AOAC, 72, (4), 1989, pp. 570—576

ПРИЛОЖЕНИЕ Б (обязательное)

Сведения о соответствии национальных стандартов Российской Федерации ссылочным международным стандартам

Обозначение ссылочного международного стандарта

Обозначение и наименование соответствующего национального стандарта

ГОСТ Р 51447-99 (ИСО 3100-1—91

Мясо и мясные продукты. Методы отбора проб

Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения

Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений

* Соответствующий национальный стандарт отсутствует. До его утверждения рекомендуется использовать перевод на русский язык данного международного стандарта. Перевод данного международного стандарта находится в Федеральном информационном фонде технических регламентов и стандартов.

Ключевые слова: мясо, мясные продукты, хлорамфеникол, левомицетин, жидкостная хроматография

Редактор В.Н. Копысов Технический редактор Н.С. Гришанова Корректор АС. Черноусова Компьютерная верстка И.А. Налейкиной

Сдано а набор 23.12.2005. Подписано в печать 19.01.2006. Формат 60 х 84 1 /«. Бумага офсетная. Гарнитура Ариал. Печать офсетная. Усл. печ.л. 0,93. Уч.-изд-л. 0,65. Тираж 206 экэ. Зак. 29. С 2353.

ФГУП «Стандартинформ», 123995 Москва, Гранатный пер., 4. www.gosUnfo.ru Набрано во ФГУП «Стандартинформ» на ПЭВМ.

Отпечатано в филиале ФГУП «Стандартинформ» — тип. «Московский печатник», 105062 Москва, Лялин пер., 6.

источник