МУК 4.2.1067-01 Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма Streptomyces cinnamonensis НИЦБ 109 — продуцента монензина в воздухе рабочей зоны
ГОСУДАРСТВЕННОЕ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЕ
НОРМИРОВАНИЕ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ГОСУДАРСТВЕННЫЕ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ
ПРАВИЛА И НОРМАТИВЫ
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Метод микробиологического измерения
концентрации клеток микроорганизма
Streptomyces cinnamonensis
НИЦБ 109 — продуцента монензина
в воздухе рабочей зоны
Минздрав России
Москва 2002
1. Разработаны к.б.н. Бару Р.В., к.б.н. Лапчинской А.В. (Государственный научный центр по антибиотикам).
2. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации — Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации 20 сентября 2001 г.
1. Общие положения и область применения . 2
2. Характеристика штамма-продуцента монензина . 2
5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы .. 2
6. Требования безопасности . 3
7. Требования к квалификации операторов . 3
9. Проведение измерений . 4
10. Вычисление результатов измерений . 4
11. Оформление результатов измерений . 5
санитарный врач Российской
Федерации — Первый заместитель
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Метод микробиологического измерения концентрации
клеток микроорганизма Streptomyces cinnamonensis
НИЦБ 109 — продуцента монензина
в воздухе рабочей зоны
Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма Streptomyces cinnamonensis НИЦБ 109-продуцента монензина в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 3000 клеток в 1 м 3 воздуха.
Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования» и ГОСТ Р 8.563-96 «Методики выполнения измерений».
Методические указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.
Микроорганизм Streptomyces cinnamonensis НИЦБ 109 является продуцентом антибиотика монензина. Штамм растет на различных агаризованных и жидких средах. Культура образует цепочки спор, обычно прямые или слегка извилистые, с гладкой оболочкой. На твердой питательной среде ISP на 3 сутки роста при температуре 28 °С образует округлые радиально-складчатые морщинистые колонии с кремовым или сероватым налетом, фестончатым краем и выпуклым более темным центром, диаметром 1-2 мм. На шестые сутки инкубации размеры колонии достигают 3-5 мм, конфигурация и складчатость колоний не изменяется, образуется воздушный мицелий со спорами бежевато-серого цвета, в среду выделяет коричневый пигмент. Штамм устойчив к следующим антибиотикам: левомицетину (30 мкг/мл), линкомицину (15 мкг/мл), полимиксину М (100 мкг/мл), эритромицину (мкг/мл), тетрациклину (30 мкг/мл) и олеандомицину (15 мкг/мл). ПДКр.з. 3000 кл/м 3 .
Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток продуцента монензина в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 5000 клеток в 1 м 3 воздуха при доверительной вероятности 0,95.
Метод основан на аспирации из воздуха клеток продуцента монензина на поверхность плотной питательной среды и подсчета выросших колоний по типичным морфологическим признакам.
При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.
5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы
Прибор для бактериологического анализа воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова) ТУ 64-12791-77
Термостаты электрические суховоздушные или водяные
Автоклав электрический ГОСТ 9586-75
Бокс, оборудованный бактерицидными лампами
Весы лабораторные, аналитические типа ВЛА-200
Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа «Биолам» Л-211
Лупа с увеличением х10 ГОСТ 25706-83
Чашки Петри бактериологические плоскодонные стеклянные, диаметром 100 мм
Пробирки биологические, вместимостью 20 и 35 мл ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1,5 и 10 мл ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1,5, и 10 мл ГОСТ 1770-74
Колбы конические, вместимостью 250 и 500 мл ГОСТ 1770-74
Марля медицинская ГОСТ 9412-77
Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556-81
Антибиотики : левомицетин, линкомицин, полимиксин М, эритромицин, тетрациклин, олеандомицин и нистатин
Спирт этиловый ректификат ГОСТ 5962-67
Селективная среда для штамма-продуцента
Среда ISP: Мальт-экстракт (Difco) — 1,5 %, дрожжевой экстракт (Difco) — 0,5 %, крахмал растворимый — 0,5 %, мел химический осажденный — 0,3 %, Бакто-агар (Difco) — 2,0 %, вода дистиллированная — 100 мл, рН 7,2-7,4.
При выполнении измерений концентрации клеток продуцента монензина в воздухе рабочей зоны соблюдают:
· правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88;
· правила электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцию по эксплуатации прибора;
· положения «Инструкций по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности» (1977).
Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются лица с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющие навыки работы в области микробиологических исследований.
Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 ± 5) °С, атмосферном давлении 630-800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80 %.
9.1. Условия отбора проб воздуха
Для определения продуцента монензина воздух аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин на поверхность плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (1-10 мин) зависит от предполагаемой концентрации клеток продуцента.
Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижный диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
Метод предполагает учет количества типичных по морфологическим признакам колоний выросших на 3-6-е сутки после посева воздуха. Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.
Селективную среду расплавляют, остужают до 60 °С, добавляют свежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде раствор одного из антибиотиков (левомицитин, линкомицин, цефалотин или другой, указанные в разделе 2) для подавления посторонней бактериальной микрофлоры и нистатина (10 мкг/мл) для подавления грибковой флоры, тщательно перемешивают и разливают по 10-15 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности. Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.
После отбора проб воздуха чашки Петри помешают в термостат при 28 °С. Через 72 ч производят подсчет выросших типичных колоний продуцента. При необходимости культуру подвергают микроскопированию.
Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 м 3 воздуха производят по формуле:
кг/м 3 , где
Х — концентрация клеток продуцента в воздухе;
N — количество колоний продуцента, выросших на чашке;
1000 — коэффициент пересчета на 1 м 3 воздуха;
V — объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).
В случае невозможности использования аппарата Кротова рекомендуется применять метод седиментации клеток продуцента из воздуха непосредственно на чашки Петри с плотной питательной средой. Время отбора проб воздуха может составлять до 60 мин. При этом пользуются следующим расчетом концентрации клеток продуцента:
эмпирически установлено, что за 5 мин на площадь 100 см 2 оседает количество бактерий, содержащееся в 10 л воздуха, за 1 мин — 2 л воздуха. Площадь чашки Петри диаметром 100 мм равна 78,54 см 2 .
на 100 см 2 за 1 мин оседает 2 л воздуха
Следовательно, на стеклянную чашку Петри за 1 мин оседает количество бактерий, содержащееся в 1,57 л воздуха.
Надо определить количество клеток в 1 м 3 воздуха. На 1 чашку (диаметр 100 мм) за 1 мин оседает количество микробов, содержащееся в 1,57 л воздуха, за Т мин — 1,57 × Т л.
В этом количестве содержится N колониеобразующих единиц (микробных клеток — спор, обрывков мицелия), а в 1 м 3 воздуха содержится
Пример: за 30 мин седиментации выросло 12 колоний микроорганизма. В 1 м 3 воздуха содержится
=253 клетки
Результаты измерений оформляют протоколом по форме.
количественного микробиологического анализа штамма Streptomyces cinnamonensis НИЦБ 109 — продуцента монензина в воздухе рабочей зоны
источник
Купить МУ 2233-80 — бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее
Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО «ЦНТИ Нормоконтроль».
Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.
- Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
- Курьерская доставка (7 дней)
- Самовывоз из московского офиса
- Почта РФ
Методические указания распространяются на определение содержания вредных веществ в воздухе промышленных помещений при санитарном контроле.
Приложение 1. Формула для приведения объема воздуха к стандартным условиям
Приложение 2. Таблица коэффициентов для приведения объема воздуха к стандартным условиям
Чтобы бесплатно скачать этот документ в формате PDF, поддержите наш сайт и нажмите кнопку:
НА ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВРЕДНЫХ ВЕЩЕСТВ В ВОЗДУХЕ
Сборник методических указаний составлен методической секцией по промышленно-санитарной химии при проблемной комиссии «Научные основы гигиены труда и профессиональной патологии».
Настоящие методические указания распространятся на определение содержания вредных веществ в воздухе промышленных помещений при санитарном контроле.
Редакционная коллегия: Тарасов В.В., Бабина Н.Д., Набиев Н.Н., £>яхова Г.А., Озечкин В.Г.
УТВЕВДАЮ Заместитель Главного государственного санитарного врача СССР
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ НА ФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛЕВОМИЦЕША В ВОЗДУХЕ
Левомицетия — белое ш слегка желтоватое кристаллическое вещество горького вкуса. Температура плавления 150-151,5°С. Растворим в воде, бензоле, метаноле, ацетоне. Агрегатное состояние в воздухе — хшль.
1. Определение основано на реакции нитрозироваяия левомицетива н конденсации о 1 -нафггндаыинсы.
2. Предел обнаружения 30 икг в анализируемом объеме раствора.
3. Предел обнаружения — 0,107 иг/м 3 (расчетный)
4. Погрешность определения — 9$
5. Диапазон измеряемых концентраций от 0,107 ыг/м 3 до 0,66 мг/м 8 .
6. Определению не мешают — метанол и изопропиловый спирт.
7. Предельно допустимая концентрация в воздухе 0,2 мг/м 3 .
8. Применяемые реактивы и раотворн Левомицетин, фармакопейный
Стандартный раствор готовят растворением в меркой колбе емкостью 100 ил 0,01 г левомицетина этанолом. Раствор устойчив 3 недели Спирт этиловый, ГОСТ 5963-67 Цинк металлический, чда, ГОСТ 989-62 в порошке.
Кальций хлористый, ч, ГОСТ 4460-66, I0f раствор в воде.годен х употреблению в течение 3-х дней.
1-Кафтиламин, ГОСТ 8827-58, чда, перекриоталлизованкнй из это* лового спирта. Готовят 5% раствор в ледяной уксусной кислоте. Раот-вор следует хранить в темной склянке.
9. Применяемые посуда х приборы.
Аспирационное устройство Фильтры АФА-ХА-20 Патроны
Пробирки колориметрические, плоскодонные из бесцветного стекла высотой 120 мм к внутренним диаметром 10-15. Пробирки долины иметь отметку 5 мл.
Биксы стеклянные ГОСТ 1770-74, емкостью 10 мл Колбы мерные, ГОСТ 1770-74, емкостью 100 мл Колбы конические, ГОСТ 1770-74, емкостью 50 к 100 мл Пипетки, ГОСТ 20292-74, емкостью 1,2,5 х 10 мл о ценой 0,1 и 0,01 мл.
Спектрофотометр или фотоэлектроколориметр.
10. Воздух со скоростью 15-20 л/нин аспирирувт через фильтр, укрепленный в патроне
Для определения 1/2 предельно допустимой концентрации следует отобрать 700 литров воздуха со скоростю 20 л/мин.
Срок хранения отобранных проб 3 суток, при условии храпения фильтров в темном сухом месте при комнатной температуре.
11. Фильтр переносят в Сто, заливают 5 мл этанола к оставляют на I час; периодически перемешивая содержимое бшса.
Во-истечении указанного времени фильтр тщательно отнимают стеклянной палочкой и растворы переносят в пробирку.
Для анализа отбирают 2 мл раствора, приливают 3 мл 10% раствора хлорида кальция и добавляют 10-15 иг порошка металлического цинка, помещают на 2 минута в кипящую водяную баню. После охлаждения приливают 0,5 мл 5% раствора I-нафтилакина и вновь помещают в кипящую водяную баню на 2 минуты.
По охлаждении объем раствора доводят до метки (5 мл) этанолом.
Далее фотометрируюг в кюветах с толщиной слоя 10 мм при длине волны 520 нм до сравнению с этаполом.
Содержание левомицетина в анализируемом объеме определяют по федварительно построенному градуировочному графику, для построения которого готовят шкалу стандартов согласно таблице П.
источник
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
НА ФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛЕВОМИЦЕТИНА В ВОЗДУХЕ
УТВЕРЖДЕНЫ заместителем Главного государственного санитарного врача СССР А.И.Заиченко, 23 сентября 1980 г. N 2233-80
Левомицетин — белое или слегка желтоватое кристаллическое вещество горького вкуса. Температура плавленая 150-151,5 °C. Растворим в воде, бензоле, метаноле, ацетоне. Агрегатное состояние в воздухе — пыль.
1. Определение основано на реакции нитрозирования левомицетина и конденсации с 1-нафтиламином.
2. Предел обнаружения 30 мкг в анализируемом объеме раствора.
3. Предел обнаружения — 0,107 мг/м (расчетный).
4. Погрешность определения — 9%.
5. Диапазон измеряемых концентраций от 0,107 мг/м до 0,66 мг/м.
6. Определению не мешают — метанол и изопропиловый спирт.
7. Предельно допустимая концентрация в воздухе 0,2 мг/м.
8. Применяемые реактивы и растворы
Стандартный раствор готовят растворением в мерной колбе емкостью 100 мл 0,01 г левомицетина этанолом. Раствор устойчив 3 недели.
Спирт этиловый, ГОСТ 5963-67*
_______________
* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 51723-2001. — Примечание изготовителя базы данных.
Цинк металлический, ч.д.а., ГОСТ 989-62 в порошке.
Кальций хлористый, ч., ГОСТ 4460-66, 10% раствор в воде, годен к употреблению в течение 3 дней.
1-Нафтиламин, ГОСТ 8827-58, ч.д.а., перекристаллизованный из этилового спирта. Готовят 5% раствор в ледяной уксусной кислоте. Раствор следует хранить в темной склянке.
9. Применяемые посуда и приборы.
Пробирки колориметрические, плоскодонные из бесцветного стекла высотой 120 мм и внутренним диаметром 10-15. Пробирки должны иметь отметку 5 мл.
Бюксы стеклянные ГОСТ 1770-74, емкостью 10 мл
Колбы мерные, ГОСТ 1770-74, емкостью 100 мл
Колбы конические, ГОСТ 1770-74, емкостью 50 и 100 мл
Пипетки, ГОСТ 20292-74*, емкостью 1, 2, 5 и 10 мл с ценой деления 0,1 и 0,01 мл.
__________________
* Действуют ГОСТ 29169-91, ГОСТ 29227-91-ГОСТ 29229-91, ГОСТ 29251-91-ГОСТ 29253-91. — Примечание изготовителя базы данных.
Спектрофотометр или фотоэлектроколориметр.
10. Воздух со скоростью 15-20 л/мин аспирируют через фильтр, укрепленный в патроне.
Для определения 1/2 предельно допустимой концентрации следует отобрать 700 литров воздуха со скоростью 20 л/мин.
Срок хранения отобранных проб 3 суток, при условии хранения фильтров в темном сухом месте при комнатной температуре.
11. Фильтр переносят в бюкс, заливают 5 мл этанола и оставляют на 1 час, периодически перемешивая содержимое бюкса.
По истечении указанного времени фильтр тщательно отжимают стеклянной палочкой и растворы переносят в пробирку.
Для анализа отбирают 2 мл раствора, приливают 3 мл 10% раствора хлорида кальция и добавляют 10-15 мг порошка металлического цинка, помещают на 2 минуты в кипящую водяную баню. После охлаждения приливают 0,5 мл 5% раствора 1-нафтиламина и вновь помещают в кипящую водяную баню на 2 минуты.
По охлаждении объем раствора доводят до метки (5 мл) этанолом.
Далее фотометрируют в кюветах с толщиной слоя 10 мм при длине волны 520 нм по сравнению с этанолом.
Содержание левомицетина в анализируемом объеме определяют по предварительно построенному градуировочному графику, для построения которого готовят шкалу стандартов согласно таблице 11.
источник
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ОБНАРУЖЕНИЮ, ИДЕНТИФИКАЦИИ И ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ЛЕВОМИЦЕТИНА В ПРОДУКТАХ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
Разработаны Институтом питания АМН СССР, кафедрой общей гигиены Белорусского Государственного института усовершенствования врачей Минздрава СССР.
Предназначены для контроля остаточных количеств левомицетина в пищевых продуктах санитарно-эпидемиологическими станциями, а также заводскими и сельскохозяйственными лабораториями.
Среди ряда посторонних веществ, которые могут загрязнять различные пищевые продукты, важное место занимают лекарственные средства. Наиболее часто пищевые продукты загрязняются остатками лекарственных препаратов, применяемых для профилактики и лечения животных и птицы, ускорения их роста, улучшения качества и сохранности кормов и т.п. Номенклатура лекарств, используемых в животноводстве и ветеринарии, постоянно расширяется.
К сильнодействующим лекарственным препаратам, используемым в ветеринарии и животноводстве, относятся антибиотики. Известно большое число антибиотиков, природных и полусинтетических, обладающих различными свойствами, механизмом и спектром действия, распределением в организме животного, характером метаболизма и др.
Широкое применение антибиотиков в ветеринарии и животноводстве создает определенные проблемы с точки зрения гигиены питания, требует проведения соответствующих мероприятий для снижения уровня загрязненности продуктов этими веществами, а также организации контроля за остаточными количествами препаратов в продуктах животноводства.
При систематическом поступлении в организм человека с пищей антибиотики могут вызывать различные аллергические реакции, нарушение обмена веществ, дисбактериоз, подавлять активность некоторых ферментов, изменять микрофлору, способствовать распространению устойчивых форм микроорганизмов и т.д. Следует учитывать возможность отрицательного влияния антибиотиков в сырье для пищевой промышленности на проведение ряда технологических процессов по переработке мяса, рыбы, молока и других продуктов, кроме того, наличие антибиотиков может затруднять бактериологические исследования качества продуктов животного происхождения.
В мясе, печени, почках, молоке, твороге, сметане, сыре, яйце, рыбе, меде и других продуктах довольно часто обнаруживают остаточные количества антибиотиков, что предопределяет необходимость проведения выборочного, периодического или систематического их контроля. Некоторые из перечисленных продуктов являются диетическими (молоко, творог, сметана и др.), поэтому отсутствие в них токсических и лекарственных соединений особенно важно.
В СССР остаточные количества ряда антибиотиков регламентированы предельно допустимыми концентрациями (ПДК) . К ним относятся тетрациклины (0,01 ед./г), пенициллины (0,01 ед./г) и стрептомицин (0,5 ед./г).
Медико-биологические требования и санитарные нормы качества продовольственного сырья и пищевых продуктов. М., Издательство стандартов, 1990 г.
Для контроля уровней этих антибиотиков Минздравом СССР утверждены микробиологические методы определения, которые позволяют обнаруживать и идентифицировать группы указанных веществ на уровне ПДК.
Левомицетин (хлормицетин, хлорамфеникол) — эффективный синтетический антибиотик широкого спектра действия, запрещен к использованию в животноводстве и ветеринарии для лечения скота, птицы, мясо, молоко и яйца которых предназначены для питания людей. Это связано с токсичностью левомицетина, проявляющейся в аллергических реакциях, поражении кроветворных органов и др. Однако относительная дешевизна этого препарата и высокая антибактериальная активность приводят к нелегальному использованию его в относительно высоких масштабах.
Микробиологические методы неэффективны для анализа этого антибиотика в пищевых продуктах, т.к. найденные тест-культуры малочувствительны и не позволяют осуществлять контроль за остаточными количествами левомицетина хотя бы на уровне ПДК других антибиотиков, разрешенных к применению.
В связи с этим за рубежом наиболее часто применяют химические методы определения левомицетина в пищевых продуктах с использованием хроматографического разделения.
В настоящих Методических рекомендациях впервые в СССР предпринята попытка применения для контроля остаточных количеств левомицетина в пищевых продуктах простого химического метода анализа, основанного на извлечении антибиотика экстракцией органическим растворителем, концентрировании экстракта, отделении левомицетина в тонком слое силикагеля от коэкстрактивных веществ и определении его после восстановления в виде производного с n-деметиламинобензальдегидом.
Доступность реактивов и оборудования позволяет рекомендовать этот метод для серийных анализов пищевых продуктов в условиях санэпидстанций, заводских и сельскохозяйственных лабораторий.
Предел обнаружения левомицетина на хроматографической пластинке 5 — 10 нг в зоне. Относительное стандартное отклонение при визуальном определении не превышает 0,4, при спектрофотометрическом — 0,2. Метод позволяет проводить анализ левомицетина при содержании его 0,05 мг/кг продукта и выше.
Метод состоит из следующих основных стадий:
1. Отбор и подготовка пробы.
2. Извлечение левомицетина из пищевых продуктов и концентрированного экстракта.
3. Хроматографическое разделение, идентификация и ориентировочная оценка концентрации левомицетина в экстракте.
4. Подтверждение наличия левомицетина в пробе.
5. Количественное определение и расчет содержания левомицетина в продукте.
Спектрофотометр СФ-26 или аналог
Термостат ТС-80М-2 или аналог
Азот, поверочный нулевой газ
Центрифуга настольная по 375-4261 или аналог
Ротационный испаритель с крышкой по ТУ 25-11-917
Баня масляная или глицериновая
Камера для тонкослойной хроматографии с притертой крышкой, например стеклянный четырехгранный сосуд 195 x 195 x 200 мм завода «Дружная горка».
Пластины для тонкослойной хроматографии «Силуфол» размером 15 x 15 см, ЧСФР или Сорбфил 100 x 100 (г. Краснодар) ТУ 26-11-17-89
Весы технические по ГОСТ 24104
Весы аналитические по ГОСТ 24104
Карандаш графитовый М или аналог
Цилиндры мерные вместимостью 25 и 100 мл по ГОСТ 1770
Колбы плоскодонные на 250 и 500 мл с НШ N 14,5 по ТУ 48-52
Колбы мерные на 25 мл по ГОСТ 1770
Пипетки на 5 и 10 мл по ГОСТ 20292
Колбы для упаривания на мл с НШ N 14,5 по ГОСТ 10394
Микрошприц на 10 и 25 мкл
Натрий сернокислый, безводный по ГОСТ 4166
Серная кислота по ГОСТ 14262 1 н
Натрий хлористый по ГОСТ насыщенный раствор в воде
Натрий углекислый по ГОСТ 2% водный раствор
Ацетонитрил по ТУ 6-09-3534-87
бета-глукуронидаза, водный раствор 1 мг/мл
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709
Кислота соляная, конц. по ГОСТ 3118
Хлорид олова (II), восстанавливающий реактив: 3 мл 15% раствора SnCl
(в воде) + 15 мл HCl + 180 мл H O
Однозамещенный фосфат калия
Двузамещенный фосфат натрия
Способ отбора и подготовки проб должен быть указан в нормативно-технической документации на конкретную продукцию.
Мясо . 10 +/- 0,1 г гомогенизируют с 15 мл 0,025 М фосфатного
буфера, pH 6,88 (0,34 г KH PO и 0,36 г Na HPO растворяют в 100 мл
дистиллированной воды), добавляли 200 мкл водного раствора
бета-глукуронидазы и инкубировали 1,5 часа при 37 °С. Гомогенат
экстрагировали 3 x 30 мл этилацетата, при необходимости применяя для
расслоения суспензии центрифугирование 5 — 10 мин. при 4000 об./мин.
Этилацетатный слой объединяли.
Аналогично извлекали левомицетин из мясных продуктов, органов и
Молоко . 25 +/- 0,1 мл насыщают 10 г Na SO , приливают 10 мл
этилацетата и 5 мл 1 н H SO , интенсивно встряхивают 1 — 2 мин. Для
расслоения эмульсии применяют центрифугирование 5 — 10 мин. при 4000
об./мин. Этилацетат декантируют, а супернатант экстрагируют последовательно
30 и 20 мл этилацетата, при необходимости применяя центрифугирование для
Аналогично извлекали левомицетин из кефира, ряженки, йогуртов.
Яйцо . 10 +/- 0,1 г гомогената яйца перетирают с 5 г Na SO ,
приливают 40 мл этилацетата и 5 мл 1 н H SO , перемешивают и центрифугируют
5 — 10 мин. при 4000 об./мин. Этилацетатный слой декантируют, а водную
часть экстрагируют последовательно 30 и 20 мл этилацетата, при
необходимости применяя центрифугирование для расслоения. Объединенные
этилацетатные экстракты из продуктов промывают последовательно 10 мл 2%
раствора Na CO , насыщенного NaCl, и 10 мл насыщенного раствора NaCl.
Яичный порошок предварительно разводят водой до консистенции
Органический слой отбирают и упаривают на ротационном испарителе при
исчезновения запаха этилацетата, добавляют 3 мл смеси ацетонитрил — вода
1:4 и экстрагируют 3 x 5 мл петролейного эфира. Петролейный эфир
отбрасывают и извлекают левомицетин этилацетатом (3 x 5 мл). Этилацетатный
экстракт сушат над Na SO (1 г), декантируют, промывают 3 мл этилацетата
сульфат натрия, объединяют его с экстрактом и упаривают на ротационном
испарителе при температуре
Отвешивают 25 мг левомицетина, помещают в мерную колбу на 25 мл и растворяют в метаноле, концентрация левомицетина — 1 мг/мл. 0,25 мл полученного раствора помещают в мерную колбу на 25 мл и разбавляют метанолом. Концентрация левомицетина в стандартном растворе 10 нг/мкл.
При анализе сметаны ее разбавляют в 2,5 — 5 раз в зависимости от жирности. Сыры и творог гомогенизируют с водой до получения гомогенной массы.
На пластинку для тонкослойной хроматографии наносят (рис. а — рисунки здесь и далее не приводятся): в точки 1, 3 и 5 соответственно 1, 2 и 4 мкл раствора стандарта, а в точки 2 и 4 соответственно 3 и 10 мкл концентрированного экстракта.
Пластинку помещают в камеру для ТСХ и хроматографируют в системе
растворителей хлороформ — метанол 10:1. По достижении фронтом элюента
верхнего края пластинки ее вынимают, сушат, опрыскивают раствором SnCl в
HCl, оставляют на 15 мин. и опрыскивают раствором
n-диметиламинобензальдегида. Появление желтых пятен на хроматографической
пластинке по оттенку и R , соответствующих пятнам стандарта,
свидетельствует о возможном присутствии левомицетина в продукте. Сравнивая
интенсивность окраски пятен стандартов и опытной пробы, ориентировочно
оценивают содержание левомицетина в экстракте.
4. Подтверждение наличия левомицетина в пробе
Аликвотную часть экстракта (50 — 100 мкл) упаривают досуха, добавляют
150 мкл 10% раствора HCl, греют на масляной бане при температуре 98 °С в
течение 30 мин., отдувают досуха азотом и приливают 200 мкл 2% метанольного
На хроматографическую пластинку наносят 5 — 10 мкл полученной пробы и
соответствующее количество стандарта левомицетина (с учетом предварительной
оценки содержания левомицетина в экстракте); пластинку помещают в камеру
для ТСХ и хроматографируют в системе растворителей хлороформ — метанол —
уксусная кислота — вода 12:5:4:2.
По достижении фронтом элюента верхнего края пластинки ее вынимают,
сушат, опрыскивают раствором SnCl в HCl, оставляют на 15 мин. Вновь
опрыскивают раствором n-диметиламинобензальдегида. Появление желтых пятен
на хроматографической пластинке по оттенку и R , соответствующих пятнам
стандарта, подтверждает наличие левомицетина в продукте.
5. Количественное определение и расчет
содержания левомицетина в продукте
При необходимости точного количественного определения левомицетина в
пищевом продукте на хроматографическую пластинку наносят в несколько точек,
близко расположенных друг к другу, аликвотную часть экстракта и таким же
образом раствор стандарта так, чтобы количество левомицетина в нем было
близко к установленному в пробе при ориентировочной визуальной оценке.
Пластинку хроматографируют и опрыскивают как в п. 3.2. Вырезают зоны
левомицетина в опытной пробе, стандарте и соответствующую по R и площади
зону на пластинке, служащую контролем (рис. б). Зоны элюируют 3 x 1 мл
метанола, метанол упаривают досуха, приливают 200 мкл 5% раствора SnCl в
5% HCl, греют при температуре 98 °С в течение 1 часа; пробы охлаждают,
добавляют по 2 мл 1% раствора n-диметиламинобензальдегида в метаноле, 1 мл
метанола и измеряют оптическую плотность полученных растворов опытной пробы
и стандарта относительно контрольной пробы на спектрофотометре в кюветах с
l = 10 мм при лямбда = 430 нм.
Рассчитывают содержание левомицетина в пробе продукта по формуле:
k — коэффициент, учитывающий полноту извлечения левомицетина из
пищевого продукта и равный 1,33 для мяса, 1,13 — для молока и 1,25 — для
ОП — оптическая плотность элюата опытной пробы, относ. ед.;
ОП — оптическая плотность элюата стандарта, относ. ед.;
P — количество стандарта левомицетина, нанесенного на пластинку, мкг;
V — объем анализируемой пробы, мкл;
V — объем аликвотной части экстракта, взятой для количественного
M — масса образца пищевого продукта, кг (л).
Интервал определяемых масс левомицетина составляет 0,5 — 6,0 мкг.
Вычисления проводят до второго десятичного знака.
За окончательный результат испытаний принимают среднее арифметическое двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает 20%.
Окончательный результат округляют до первого десятичного знака.
В случае обнаружения остаточных количеств левомицетина и подтверждения правильности его идентификации в исследуемых пищевых продуктах вопрос с их реализацией решается согласно «Методическим указаниям по определению остаточных количеств антибиотиков в продуктах животноводства». Москва, Минздрав СССР, ГОЭУ. 1985 г., 34 с.
N 3049-84 от 29 июня 1984 г.
Представленные рекомендации являются первой в СССР попыткой наладить систематический контроль за наличием и уровнями левомицетина в пищевых продуктах. До настоящего времени анализ левомицетина при необходимости выполняли микробиологически. Однако, отсутствие чувствительных тест-культур не позволяет рассчитывать на обнаружение микрограммовых количеств этого антибиотика такими способами. В связи с этим особенно важно создание химического метода контроля остаточных количеств левомицетина, позволяющего с небольшими затратами обнаружить, идентифицировать и количественно определить его содержание. Левомицетин обладает определенной токсичностью и поэтому запрещен к использованию как у нас в стране, так и за рубежом для лечения, например, лактирующих коров или кур-несушек. Анализ литературных данных позволяет сделать заключение, что применение его для лечения сельскохозяйственных животных и птицы — достаточно частое явление, оправданное дешевизной и эффективностью препарата.
Интенсификация сельскохозяйственного производства может стать одной из причин снижения качества пищевых продуктов и, в частности, загрязнения их антибиотиками. Поэтому своевременный и надежный контроль за наличием левомицетина становится важным и актуальным.
Все отмеченное позволяет рекомендовать утвердить разработанные методические рекомендации для внедрения в практику работы учреждений Госсаннадзора. Полученные этим методом материалы целесообразно обобщить для создания общей картины частоты и уровней загрязнения пищевых продуктов БССР левомицетином.
Руководитель отдела гигиены питания
Института питания АМН СССР, профессор
Ассоциация содействует в оказании услуги в продаже лесоматериалов: дрова колотые по выгодным ценам на постоянной основе. Лесопродукция отличного качества.
источник
Методические указания распространяются на определение содержания вредных веществ в воздухе промышленных помещений при санитарном контроле.
| Тип товара: | Издание с голограммой и печатью |
| Количество страниц: | 10 стр. |
| Формат: | 60х84/8, 205х290 |
| Тип обложки: | Мягкая обложка |
| Вес в упаковке: | 46 гр. |
| показать все характеристики | |
| Статус документа: | Справочные материалы, МП, ТПР |
| Дата начала действия: | 14 дек. 2011 г. |
| Количество страниц: | 10 стр. |
| Когда и где опубликован: | Бюллетень нормативных актов федеральных органов исполнительной власти от 20 апреля 2009 г. N 16 |
| Издан: |
|
| Утвержден: |
|
| Содержание: | I Общая часть II Реактивы и аппаратура III Отбор проб воздуха IV Описание определения Приложение 1. Формула для приведения объема воздуха к стандартным условиям Приложение 2. Таблица коэффициентов для приведения объема воздуха к стандартным условиям |
| Ссылки в документе: |
|
| Разделы классификатора: |
|
ОТКАЗ ОТ ГАРАНТИЙ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ
Скан-копия представлена для ознакомления и может быть не актуальна
Печатное издание полностью актуализировано на текущую дату
Нет загруженных изображений
Мы работаем только по безналичному расчету и предоплате. Причина в том, что в большинстве случаев Покупателю НТД требуются первичные бухгалтерские документы, подтверждающие факт приобретения литературы именно той организацией, которая и является заказчиком сертификации (аккредитации, аттестации). Предоставление органу сертификации НТД, принадлежащих (приобретенных) третьей стороной, является нарушением (точнее, не выполнением) соответствующих условий, определенных в Порядке проведения сертификации.
Наложенный платеж не используется по той же причине.
Физическое лицо может приобрести НТД таким же способом, что и юридическое – по безналичному расчету. Счет на оплату будет выставлен на ФИО Покупателя.
Оплатить такой счет можно в любом отделении Сбербанка (без заполнения дополнительных квитанций) или самостоятельно Покупателем, через систему Интернет-банк при наличии подключенной услуги.
Осуществляем почтовую (или транспортной компанией) доставку литературы по любому адресу. В г. Москва возможен самовывоз или курьерская доставка НТД.
Адрес пункта выдачи заказов: г. Москва, Б. Новодмитровская ул., д.23, ММЗ «Знамя» (карта проезда).
источник
«Определение остаточных количеств левомицетина (хлорамфеникола, хлормицетина) в продуктах животного происхождения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и иммуноферментного анализа. Методические указания. МУК 4.1.1912-04»
Документ по состоянию на август 2014 г.
Утверждаю
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации,
Первый заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
6 марта 2004 года
Дата введения —
1 мая 2004 года
1. Разработаны: ГУ НИИ питания РАМН (В.А. Тутельян, С.А. Хотимченко, С.А. Шевелева, В.К. Кирничная, Т.В. Киселева, Н.Г. Орлова, Н.Р. Ефимочкина, Н.В. Барбер), Московским государственным университетом им. М.В. Ломоносова (А.М. Егоров, А.Ю. Колосова, Ж.В. Самсонова).
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Минздрава России.
3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г. Онищенко 6 марта 2004 г.
4. Введены в действие 1 мая 2004 г.
Настоящие Методические указания предназначены для учреждений госсанэпидслужбы Минздрава РФ и других ведомств, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов в соответствии с СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов».
Методические указания распространяются на методы с различным целевым назначением (арбитраж, скрининг). Два метода определения остаточных количеств левомицетина (хлорамфеникола, хлормицетина) в продуктах животного происхождения:
I — высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ);
II — иммуноферментного анализа (ИФА).
Среди ряда веществ, которые могут контаминировать продовольственное сырье и пищевые продукты, важное место занимают ветеринарные препараты, используемые как для лечения животных, так и в качестве стимуляторов роста. Сильнодействующими лекарственными препаратами, используемыми в ветеринарии, остаются антибиотики. Известно большое число антибиотиков, обладающих различными свойствами, механизмом и спектром действия, распределением в организме животных, характером метаболизма и т.д.
Систематическое поступление в организм человека антибиотиков с продуктами питания крайне вредно, поскольку они могут оказывать нежелательные эффекты, чаще всего в виде возникновения аллергических реакций, дисбактериозов, подавлять активность некоторых ферментов, изменять микрофлору кишечника, способствовать распространению устойчивых форм микроорганизмов и т.д. Следует учитывать возможность отрицательного влияния антибиотиков в сырье для пищевой промышленности на проведение ряда технологических процессов в переработке мяса, рыбы, молока (в частности, при получении кисломолочных продуктов) и других продуктов. Кроме того, наличие антибиотиков может затруднять бактериологические исследования качества продуктов животного происхождения.
Хлорамфеникол (далее — ХАФ) является антибиотиком широкого спектра действия, обладающим высокой активностью в отношении бактерий и риккетсий. В отличие от многих антибиотиков ХАФ обладает довольно простым химическим строением.
Хлорамфеникол малорастворим в воде, но хорошо в спирте. Установлено, что ХАФ медленно выводится из организма животных и сравнительно долго сохраняет свою активность при хранении продуктов.
В настоящее время для определения ХАФ в продуктах питания применяют ряд методов, в их числе микробиологические методы, которые являются сравнительно простыми и дешевыми, однако отличаются недостаточной специфичностью и воспроизводимостью результатов.
Для арбитражных исследований вводятся хроматографические методы, в частности ВЭЖХ, позволяющий раздельно определять как ХАФ, так и его метаболиты.
Количественный метод определения ХАФ при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии в сельскохозяйственных продуктах отличается низким пределом обнаружения (0,01 мг/кг), хорошей воспроизводимостью (относительное стандартное отклонение 0,15 — 0,21) и надежностью.
Для скрининговых целей в мире широко применяют методы иммунохимического анализа, обеспечивающие высокую чувствительность, специфичность и точность. Для контроля пищевой продукции предпочтение отдается методам твердофазного иммуноферментного анализа, которые являются высокочувствительными (предел обнаружения — 0,00008 мг/кг).
Методические указания предназначены для учреждений госсанэпидслужбы Минздрава РФ и других ведомств, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов. Согласно СанПиН 2.3.2.1078-01 содержание левомицетина в продуктах животного происхождения не допускается.
Отбор и подготовка проб аналогичны для обоих методов исследования.
Отбор продуктов питания осуществляется в соответствии с требованиями ГОСТов на исследуемые продукты: ГОСТ 7269-79 «Мясо», ГОСТ 7202.0-74 «Мясо птицы», ГОСТ 3622-68 «Молоко и молочные продукты».
Отобранные образцы продуктов герметично упаковывают в полиэтиленовые мешки, стеклянные банки с притертыми крышками или укладывают в коробки. Образцы доставляют в лабораторию для анализа сразу же после отбора проб или, в случае необходимости, хранят на холоде, а для скоропортящихся продуктов осуществляют замораживание -4 — -10 °С, используя для этой цели холодильники или соответствующие приспособления.
К исследованию скоропортящихся образцов следует приступать в день их доставки в лабораторию. При отсутствии такой возможности образцы должны хранить при указанной выше температуре не более двух недель со времени отбора среднего образца.
4. Определение остаточных количеств левомицетина (хлорамфеникола, хлормицетина) в продуктах животного происхождения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
Метод основан на извлечении хлорамфеникола экстракцией этилацетатом, последовательной промывке экстракта разбавленным раствором щелочи и кислоты, обезжиривании петролейным эфиром и хроматографическом разделении с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии в обращенно-фазном варианте.
Помещение, в котором проводится определение хлорамфеникола, должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Все операции анализа необходимо проводить в вытяжном шкафу с использованием индивидуальных средств защиты.
4.4.1. Приготовление растворов
Взвешивают 25 мг левомицетина, помещают в мерную колбу на 25 куб. см и растворяют в метаноле, концентрация левомицетина 1 мг/мл. В мерную колбу на 25 куб. см помещают 0,25 куб. см полученного раствора и разбавляют метанолом до метки. Концентрация левомицетина в стандартном растворе 10 нг/мкл.
Для подтверждения наличия левомицетина к 50 мкл метанольного экстракта приливают 50 мкл 10%-ного раствора КОН и нагревают 20 мин. при 70 °С, 10 мкл полученного раствора вводят в тех же условиях в колонку жидкостного хроматографа. На полученной хроматограмме пик с временем удерживания левомицетина отсутствует. Это подтверждает наличие левомицетина в образце.
4.8.1. За окончательный результат измерения принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. Окончательный результат округляют до второго десятичного знака.
МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХЛОРАМФЕНИКОЛА В ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ (МОЛОКЕ, МЯСЕ, ЯЙЦАХ)
4.8.2. Если расхождение результатов двух параллельных определений (сходимость и воспроизводимость) превышает требования по п. 4.8.1, то повторно проводят два новых параллельных определения.
5. Определение хлорамфеникола (левомицетина) в продуктах животного происхождения (молоке, мясе, яйцах) методом иммуноферментного анализа
В основу метода количественного определения ХАФ в продуктах питания положен принцип твердофазного конкурентного ИФА на полистироловых планшетах. Принцип метода основан на конкуренции свободного ХАФ из измеряемой пробы и ХАФ, предварительно иммобилизованного на твердой фазе в составе белкового конъюгата, за центры связывания специфичных к ХАФ антител. После отделения несвязавшихся реагентов количество антител, прореагировавших с иммобилизованным антигеном, определяют с помощью антивидовых антител, меченных пероксидазой хрена. Количество связавшегося с антителами конъюгата вторичных антител выявляют с помощью субстрат-хромогенной смеси. Количество определяемого антибиотика, содержащегося в исследуемом образце, обратно пропорционально регистрируемой оптической плотности продукта ферментативной реакции.
Пределы обнаружения метода — 0,000012 — 0,00008 мг/кг.
5.3.2. Состав набора «Ридаскрин Левомицетин»
Микротитровальный планшет на 96 лунок (12 стрипов по 8 лунок), сенсибилизированных антителами «захвата» — 1 шт.
Комплект стандартных растворов левомицетина со следующими концентрациями: 0; 0,5; 1,5; 4,5; 13,5; 40,5 нг/куб. см в буферном растворе по 1,3 мл — 6 шт.
Конъюгат левомицетина с пероксидазой — 0,7 куб. см.
Антитела к левомицетину — 0,7 куб. см.
Субстрат, содержит пероксид карбамида — 7 куб. см.
Хромоген, содержит тетраметилбензидин — 7 куб. см.
Стоп-реагент, содержит 1 N серную кислоту — 14 куб. см.
Буфер 1, для разбавления стандартных растворов левомицетина, конъюгата, антител, растворов образцов и буфера 2 — 100 куб. см.
Буфер 2, для разбавления стандартных образцов при анализе молока — 1 куб. см.
Наборы рассчитаны на проведение анализа в 2-х повторностях 41 исследуемого образца и 6 калибровочных проб (всего 96 определений на один планшет).
5.3.3. Аналитические характеристики наборов
Специфичность. Использование высоко аффинных антител к ХАФ обеспечивает высокую специфичность анализа. Процент перекрестной реакции с сукцинатом ХАФ составляет 25%, с дезацилированным ХАФ, являющимся одним из метаболитов антибиотика, — менее 1%, с антибиотиками других групп — менее 1%.
Чувствительность. Минимальная концентрация ХАФ, определяемая с помощью набора, составляет 0,00008 мг/кг (куб. дм).
Воспроизводимость. Коэффициент вариации результатов определений концентраций ХАФ с помощью набора не превышает 12%.
Тест на открытие. Процент открытия составляет 70 — 130%.
Линейность. Линейность составляет 90 — 110%.
Диапазон определяемых концентраций 0,0001 — 0,1 мг/кг (куб. дм).
Проверка набора. При параллельном определении концентрации хлорамфеникола в продуктах питания животного происхождения с помощью набора ИФА-ХАФ и метода ВЭЖХ коэффициент корреляции составляет 0,975.
5.3.3.2. Набор «Ридаскрин Левомицетин»
Чувствительность (пределы обнаружения) — 0,000012 — 0,00005 мг/кг (куб. дм).
Перекрестная чувствительность: левомицетин — 100%, левомицетин основной — 0,5%, тиамфеникол — менее 0,05%. Нет чувствительности к тетрациклинам, гентамицину, ампициллину и флорфениколу.
Все компоненты наборов, за исключением о-фенилендиамина, в используемых концентрациях не токсичны. О-фенилендиамин обладает канцерогенным действием. Поэтому в случае попадания вещества на кожные или слизистые покровы следует немедленно тщательно смыть его большим количеством воды. Стоп-реагент содержит в своем составе серную кислоту. Следует избегать контакта стоп-реагента с кожей.
Все разведения реагентов и расчеты представлены для проведения анализа на 1 планшете.
Построение калибровочной кривой необходимо проводить для каждого планшета.
5.5.1. Приготовление реагентов
5.5.1.1. Приготовление фосфатно-солевого буфера, содержащего детергент (ФСБТ)
Содержимое двух флаконов с фосфатно-солевым буферным раствором количественно перенести в стакан и довести общий объем раствора до 400 куб. см дистиллированной водой. Полученный буфер может храниться закрытым в течение 5 дней при температуре не выше 2 — 8 °С.
5.5.1.2. Приготовление буфера 1
Содержимое флакона с концентратом буфера количественно перенести в стакан и довести общий объем раствора до 50 куб. см ФСБТ. Полученный буфер может храниться в течение 5 дней при температуре 2 — 8 °С.
5.5.1.3. Приготовление образцов для анализа
Молоко. Пробу молока развести перед анализом в 100 раз буфером 1.
Мясо. Встряхивают 3 г измельченной ткани (фарша) с 6 куб. см этилацетата в течение 5 мин., затем центрифугируют в течение 10 мин. Упаривают досуха 1 куб. см верхней фазы. Осадок перемешивают с 3 куб. см ФСБТ и центрифугируют при 3000 g в течение 5 мин. Супернатант отбирают и разводят в 50 раз ФСБТ.
Яйца. Взвешивают по 3 г смешанного (гомогенизированного) содержимого яйца в реакционную посуду и проводят дальнейшую пробоподготовку, как описано для образцов мяса.
5.5.1.4. Приготовление калибровочных проб (КП)
Калибровочные пробы готовятся заново при каждом определении.
Молоко. Калибровочные пробы готовятся из стандартного раствора ХАФ в метаноле (1 мг/куб. см) по следующей схеме.
1. Приготовить 5 куб. см раствора ХАФ в ФСБТ с концентрацией 0,01 мг/куб. см (5 куб. см раствора содержат 0,05 куб. см стандартного раствора ХАФ в метаноле).
2. Приготовить 1 куб. см калибровочной пробы 6 (КП 6) в буфере 1 с концентрацией 100 нг/куб. см (1 куб. см раствора содержит 0,01 куб. см раствора, приготовленного на стадии 1).
3. Последующие калибровочные пробы готовят по схеме из КП 6 с использованием буфера 1:
Мясо (яйца). Калибровочные пробы готовятся из стандартного раствора ХАФ в метаноле (1 мг/куб. см) по вышеприведенной схеме. На всех стадиях используется буфер ФСБТ.
5.5.1.5. Приготовление рабочего раствора антител
Рабочий раствор антител готовится непосредственно перед использованием.
Содержимое одного флакона с лиофилизированными антителами растворить в 6 куб. см ФСБТ. Полученный раствор хранению не подлежит.
5.5.1.6. Приготовление рабочего раствора конъюгата
Рабочий раствор конъюгата готовится непосредственно перед использованием.
Содержимое одного флакона с конъюгатом количественно перенести в стакан и довести общий объем до 15 куб. см ФСБТ — при анализе образцов молока и до 30 куб. см — при анализе образцов мяса и яиц. Полученный раствор хранению не подлежит.
5.5.1.7. Приготовление субстратно-хромогенной смеси
Субстратно-хромогенную смесь готовят непосредственно перед использованием.
Для приготовления раствора применять только химически чистую посуду.
В 11,25 куб. см дистиллированной воды растворить 1 таблетку о-фенилендиамина, тщательно перемешивая и избегая попаданий света. К полученному раствору количественно добавить 1,25 куб. см концентрата субстратного буферного раствора. Субстратно-хромогенная смесь, подготовленная к работе, хранению не подлежит.
Внесение реагентов следует проводить согласно схеме:
5.5.2.1. В два ряда лунок планшета внести калибровочные пробы (КП), приготовленные по п. 5.5.1.4, по 0,05 куб. см, начиная с минимальной концентрации. Рекомендуется не вносить калибровочные пробы в крайние ряды планшета во избежание влияния краевого эффекта. При разнице более 0,1 единицы оптической плотности в результатах параллельных проб на крайних рядах учитывать результат крайнего ряда не следует.
В оставшиеся лунки внести в дубликатах исследуемые образцы в объеме 0,05 куб. см.
Процедуру внесения образцов следует выполнять как можно быстрее. Вся операция не должна превышать 12 — 15 мин.
5.5.2.2. Во все лунки планшета внести по 0,05 куб. см рабочего раствора антител, приготовленного по п. 5.5.1.5. Антитела вносить в лунки планшета в той же последовательности, что и калибровочные пробы и исследуемые образцы.
5.5.2.3. Плотно закрыть планшет крышкой и выдержать при температуре 37 °С в течение 1,5 ч в термостате.
5.5.2.4. Содержимое лунок удалить стряхиванием. Затем провести отмывку. Для этого в каждую лунку планшета внести по 0,35 куб. см промывочного буферного раствора, оставить на 1 — 2 мин., а затем удалить содержимое лунок стряхиванием. Процедуру повторить 4 раза. После этого тщательно удалить остатки влаги из лунок, несколько раз вытряхнув планшет о марлевую салфетку или фильтровальную бумагу.
5.5.2.5. Во все лунки планшета внести по 0,1 куб. см рабочего раствора конъюгата, приготовленного по п. 5.5.1.6.
5.5.2.6. Плотно закрыть планшет крышкой и выдержать при температуре 37 °С в течение 1 ч в термостате.
5.5.2.7. Содержимое лунок удалить стряхиванием. Затем провести отмывку. Для этого в каждую лунку планшета внести по 0,35 куб. см промывочного буферного раствора, оставить на 1 — 2 мин., а затем удалить содержимое лунок стряхиванием. Процедуру повторить 5 раз. После этого тщательно удалить остатки влаги из лунок, несколько раз вытряхнув планшет о марлевую салфетку или фильтровальную бумагу.
5.5.2.8. Во все лунки планшета внести по 0,1 куб. см раствора субстратно-хромогенной смеси и выдержать планшет при комнатной температуре 18 — 25 °С в темном месте в течение 30 — 35 мин. при анализе образцов молока и 7 — 10 мин. — при анализе образцов мяса или яиц.
5.5.2.9. Внести во все лунки планшета по 0,35 куб. см стоп-реагента (раствора серной кислоты).
5.5.2.10. Измерить оптическую плотность в лунках планшета при длине волны 490 нм. Окраска планшета стабильна в течение 1 ч в темноте.
Построить калибровочную кривую зависимости оптической плотности от концентрации ХАФ в калибровочных пробах (следует использовать логарифмический масштаб для оси абсцисс). Соединить кривой (по лекалу) полученные точки. Образец калибровочной кривой приведен ниже (не приводится).
Рассчитать средние арифметические значения показателей оптической плотности испытуемых образцов и по калибровочной кривой определить в них концентрацию ХАФ, учитывая фактор разбавления, который равен 100, для всех образцов.
5.5.4. Условия хранения и эксплуатации набора
Набор реагентов ИФА-ХАФ должен храниться при температуре 2 — 8 °С в течение всего срока годности. Допускается хранение набора при температуре до 25 °С не более 5 суток. Срок годности набора — 12 мес. Компоненты набора перед использованием необходимо выдержать при комнатной температуре 18 — 25 °С не менее 30 мин. Раствор антител, конъюгата и субстратно-хромогенная смесь хранению не подлежат. Промывочный буферный раствор может храниться после разведения при температуре 2 — 8 °С в течение 5 дней. При вскрытии и растворении лиофилизированных компонентов набора необходимо следить, чтобы на пробках не осталось сухого вещества.
Образцы, предназначенные для анализа, должны храниться в холодильнике, в темном месте.
Пробу молока объемом 5 куб. см охладить до 8 °С, перенести в стеклянную центрифужную пробирку, центрифугировать при 4 — 12 °С в течение 15 мин. при 3000 g. Удалить верхний слой жира и перенести аликвоту обезжиренного молока в новую чистую пробирку. Для анализа использовать 0,05 куб. см раствора на 1 лунку планшета. Фактор разбавления — 1. Предел обнаружения — 0,00005 мг/кг. Предел количественного обнаружения — 0,00015 мг/кг.
Примечание: для приготовления стандартных растворов для измерения проб молока использовать буфер 2.
5.6.1.2. Исследования сухого молока
Взвесить в центрифужной стеклянной пробирке 2 г сухого молока, добавить 10 куб. см дистиллированной воды и встряхивать пробирку до растворения пробы. Добавить в пробирку по 1 куб. см осадителя 1 и осадителя 2. Пробы тщательно перемешать на вортексе и центрифугировать при 4 — 12 °С в течение 10 мин. при 3000 g. Перед центрифугированием пробы охладить до 8 °С, перенести 3,6 куб. см супернатанта (что соответствует 0,6 г сухого молока) в чистую пробирку. Добавить в пробирку 6 куб. см этилацетата и экстрагировать встряхиванием в течение 10 мин. Центрифугировать при комнатной температуре (20 — 25 °С) в течение 10 мин. при 3000 g.
Перенести 4 куб. см эфирного экстракта (соответствует 0,4 г сухого молока) в новую чистую пробирку и испарить экстракт досуха при 60 °С в слабом токе азота. Растворить сухой остаток в 0,4 куб. см буфера 1 и тщательно перемешать на вортексе. Для анализа используют 0,05 куб. см раствора на 1 лунку планшета.
Гомогенизировать пробу массой не менее 100 г в гомогенизаторе. Взвесить в стеклянной центрифужной пробирке 3 г гомогената, смешать с 3 куб. см дистиллированной воды и добавить 6 куб. см этилацетата. Интенсивно встряхивать пробирку по оси «вверх-вниз» в течение 10 мин. Центрифугировать при комнатной температуре (20 — 25 °С) в течение 10 мин. при 3000 g.
Перенести 4 куб. см эфирного экстракта (соответствует 2 г пробы) в новую чистую пробирку и испарить экстракт досуха на микроиспарителе при 60 °С в слабом токе азота. Растворить сухой остаток в 1 куб. см смеси изооктана с хлороформом в соотношении 2:3 и тщательно перемешать на вортексе. Добавить к раствору 0,5 куб. см буфера 1 и интенсивно перемешивать на вортексе в течение 1 мин. Центрифугировать при комнатной температуре (20 — 25 °С) в течение 10 мин. при 3000 g или более высоком ускорении.
Для анализа использовать 0,05 куб. см раствора (водный верхний слой ) на 1 лунку планшета.
В случае образования пены или геля в межфазовой зоне при недостаточном объеме водной фазы поместить пробирку на 5 мин. в водяную баню при температуре 80 °С и затем еще раз центрифугировать.
Гомогенизировать пробу массой не менее 100 г смешанного содержимого яйца в гомогенизаторе. Взвесить в стеклянной центрифужной пробирке 2 г гомогената, смешать с 12 куб. см этилацетата. Интенсивно встряхивать пробирку по оси «вверх-вниз» в течение 10 мин. Центрифугировать при комнатной температуре (20 — 25 °С) в течение 10 мин. при 3000 g.
Перенести 6 куб. см эфирного экстракта (соответствует 1 г пробы) в новую чистую пробирку и испарить экстракт досуха при 60 °С в слабом токе азота. Растворить сухой остаток в 1 куб. см смеси изооктана с хлороформом в соотношении 2:3 и тщательно перемешать на вортексе.
Добавить к раствору 1 куб. см буфера 1 и интенсивно перемешивать на вортексе в течение одной минуты. Центрифугировать при комнатной температуре (20 — 25 °С) в течение 10 мин. при 3000 g или более высоком ускорении.
Для анализа использовать 0,05 куб. см раствора (водный верхний слой ) на лунку планшета.
В случае образования пены или геля в межфазной зоне при недостаточном объеме водной фазы поместить пробирку на 5 мин. в водяную баню при температуре 80 °С и затем еще раз отцентрифугировать.
5.6.2.1. Предварительная подготовка
Перед использованием набора довести температуру всех реагентов до комнатной температуры (20 — 25 °С). Немедленно после использования охладить все оставшиеся реагенты до температуры 2 — 8 °С.
В процессе выполнения анализа не допускать высыхания лунок планшета.
На всех стадиях инкубации избегать воздействия прямого солнечного света. При инкубации планшета закрыть его непрозрачным экраном.
5.6.2.2. Приготовление раствора конъюгата
Перед разбавлением концентрированного раствора конъюгата осторожно встряхнуть содержимое флакона. Для приготовления рабочего раствора конъюгата разбавить концентрат конъюгата буферным раствором 1, имеющимся в комплекте набора, в отношении 1:11 (например, смешать 0,2 куб. см концентрата конъюгата с 2 мл буфера — данного разведения достаточно для 4-х стрипов по 8 лунок).
5.6.2.3. Приготовление раствора антител
Перед разбавлением концентрата антител осторожно встряхнуть содержимое флакона. Для приготовления рабочего раствора антител разбавить концентрат буферным раствором 1, имеющимся в комплекте набора, в отношении 1:11 (например, смешать 0,2 куб. см концентрата антител с 2 куб. см буфера 1 — данного разведения достаточно для 4-х стрипов).
5.6.2.4. Приготовление буферного раствора 2 (только для проб молока)
Для приготовления готового буферного раствора 2, использующегося при исследовании проб молока, разбавить концентрат буфера 2 в 9 куб. см буферного раствора 1 и энергично перемешать с помощью встряхивателя типа «вортекс», периодически подогревая раствор до 40 °С. Мутность раствора не влияет на результат определения, однако осадок на дне флакона после перемешивания должен равномерно распределяться в объеме раствора.
5.6.2.5. Подготовка микротитровального планшета
Перед выполнением анализа из планшета следует извлечь необходимое количество стрипов.
Остальные стрипы следует тщательно упаковать в фольгированный пакет вместе с осушителем, закрыть застежку пакета и поместить на хранение при температуре 2 — 8 °С.
5.6.2.6. Приготовление стандартных растворов
Для приготовления рабочих стандартных растворов левомицетина концентрированные растворы, входящие в состав набора, следует разбавить буфером 1 (или буфером 2) в указанной пропорции. Для разбавления использовать только стеклянную посуду.
После разбавления тщательно перемешивать готовые растворы.
Для каждой серии исследований следует готовить свежие стандартные растворы.
При исследовании образцов молока для разведения стандартов использовать буферный раствор 2.
Вставить в рамку планшета стрипы (лунки) в количестве, необходимом для выполнения всех запланированных определений в двух повторностях. Записать координаты лунок, предназначенных для стандартных растворов и подготовленных исследуемых растворов. Пример формы записи приведен на рис. 1.
5.6.3.1. Добавить по 0,05 куб. см стандартных растворов и растворов исследуемых образцов в соответствующие пары лунок.
5.6.3.2. Добавить по 0,05 куб. см разбавленного раствора конъюгата в каждую лунку.
5.6.3.3. Добавить в каждую лунку по 0,05 куб. см готового разбавленного раствора антител. Перемешать вручную, избегая попадания смеси в соседние лунки, и оставить на инкубацию в течение 2 ч при комнатной температуре (20 — 25 °С).
5.6.3.4. Вылить жидкость из лунок, перевернуть рамку планшета и выбить капли жидкости, оставшиеся в лунках, путем энергичного троекратного постукивания рамки с лунками по столу, накрытому фильтровальной бумагой. Наполнить лунки 0,25 куб. см дистиллированной воды и снова вылить воду. Выбить капли воды, как описано выше. Повторить процедуру промывки лунок водой еще два раза.
5.6.3.5. Добавить по 0,05 куб. см раствора субстрата и по 0,05 куб. см раствора хромогена в каждую лунку. Перемешать вручную, соблюдая осторожность, и инкубировать при комнатной температуре (20 — 25 °С) в течение 30 мин. в темноте.
5.6.3.6. Добавить в каждую лунку по 0,1 куб. см раствора стоп-реагента и хорошо перемешать вручную. В течение 60 мин. после добавления стоп-реагента измерить оптическую плотность в каждой лунке при 450 нм (нулевое считывание по воздуху).
5.6.4. Определение количества левомицетина в исследованных пробах
Средние значения оптической плотности, измеренной в лунках со стандартными и исследуемыми растворами, делятся на среднее значение оптической плотности, измеренной в лунках с первым (нулевым) стандартом, результат умножается на 100. Таким образом, результат измерения оптической плотности выражается в процентах от оптической плотности лунки с нулевым стандартом, то есть:
По величинам относительного поглощения, вычисленным для стандартных растворов, и соответствующим значениям концентрации левомицетина в нг/кг строится калибровочная кривая в полулогарифмической системе координат. Калибровочная кривая должна быть почти линейна в диапазоне 50 — 1350 нг/кг (см. рис. 2).
Концентрация левомицетина в растворах исследуемых образцов в нг/кг (или нг/куб. дм) определяется по калибровочной кривой соответственно относительному поглощению, измеренному и вычисленному для этих растворов.
Для того чтобы вычислить концентрацию левомицетина в исследуемой исходной пробе, величину концентрации левомицетина, полученную по калибровочной кривой, следует умножить на соответствующий фактор разбавления (см. п. 5.5.1.1 — 5.5.1.4). Результат исследования выражают в мг/кг или мг/куб. дм.
При выполнении пробоподготовки по п. п. 5.5.1.3 и 5.5.1.4 холостые пробы могут показывать положительный результат на уровне 2-й стандартной пробы. При расчете концентрации левомицетина в исследуемых пробах рекомендуется учитывать фоновый сигнал с помощью постановки холостого опыта. Для этого в каждой серии анализов необходимо выполнять испарение 4 куб. см чистого этилацетата и далее следовать процедуре, описанной в п. 5.5.3. Измеренный фоновый сигнал далее следует вычитать на стадии обработки результатов.
5.7.1. За окончательный результат измерения принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. Окончательный результат округляют до второго десятичного знака.
МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХЛОРАМФЕНИКОЛА В ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ (МОЛОКЕ, МЯСЕ, ЯЙЦАХ)
5.7.2. Если расхождение результатов двух параллельных определений (сходимость и воспроизводимость) превышает требования по п. 5.6.1, то повторно проводят два новых параллельных определения.
источник