Проведена разработка экспрессной и чувствительной методики количественного химического анализа проб лекарственных препаратов на содержание левомицетина методом дифференциальной вольтамперометрии. Объектами исследования служили лекарственные формы: глазные капли и таблетки. В качестве рабочего электрода выбран ртутно-пленочный электрод, который представляет собой фторопластовый стержень с запрессованной серебряной проволокой диаметром 2,0 мм длиной 9-10 мм, площадь поверхности составляет около 15,0 мм 2 , на которую нанесена пленка ртути толщиной 10-20 мкм. Преимуществом такого электрода является возможность получения более узких и высоких пиков, которые характеризуются лучшей воспроизводимостью, чем на электродах из углеродных материалов. Кроме того, ртутные электроды являются менее токсичными и более удобными в использовании, чем стационарная ртутная капля. Установлена способность левомицетина восстанавливаться на ртутнопленочном электроде в растворах фоновых электролитов: 0,1 М раствор (NH4)2S04, 0,1 М раствор КС1, 0,1 М раствор цитрата аммония двузамещен- ного (C6H14O7N2) и буферных растворах Бриттона-Робинсона pH 4,0-5,0.
Одним из определяющих факторов при определении левомицетина вольтамперометрическим методом является pH среды. С увеличением pH раствора от 3 до 5,5 потенциал восстановления левомицетина смещается в более отрицательную область на 200 мВ и ток восстановления возрастает практически в 3 раза, что, по-видимому, связано с протеканием в растворе предшествующей протолитической реакции. Диапазон определяемых концентраций составляет 10-500 мг/дм 3 . Нижняя граница определяемых содержаний составляет 0,005 мг/дм 3 . Предел обнаружения, рассчитанный по Зсг-критерию, равен 0,0039 мг/дм 3 .
Объектами анализа служили сложные многокомпонентные системы: глазные капли и таблетки, в состав которых входят различные сопутствующие вещества (крахмал картофельный, низкомолекулярный медицинский поливинилпирролидон, кальций стеариновокислый, борная кислота).
В качестве стандартных образцов использовали сухой порошок ле- вомицетина, соответствующий требованию фармакопейной статьи 42-2482-95.
Также разработана методика количественного определения азитро- мицина дигидрата в фармпрепаратах, а также проведены экспериментальные исследования его вольтамперометрического поведения.
Антибиотик обладает способностью окисляться на различных типах графитовых электродов. В качестве индикаторных электродов применяли СУ и графитовый электрод, пропитанный полиэтиленом и парафином в вакууме. Использование таких электродов обусловлено высокой химической и электрохимической устойчивостью графита, широкой областью рабочих потенциалов как в водных, так и в неводных средах, а также простотой механического обновления поверхности и требованиями техники безопасности. На рис. 5.6 представлена типичная вольтамперограмма окисления азитромицина на СУ электроде, снятая в дифференциально-импульсном режиме развертки потенциала.
Рис. 5.6. Вольтамперограмма окисления азитромицина дигидрата на СУ электроде:
7 моль/л. гэ = 30 с; w = 30 мВ/e; Еэ = 0,2 В
Значение потенциала, при котором происходит электрохимическое концентрирование, оказывает существенное влияние на высоту и форму аналитического сигнала.
Величина тока пика азитромицина на стеклоуглеродном электроде достигала максимального значения в области потенциалов 0,15 ^ 0,25 В и увеличивалась примерно в 2,4 раза.
При анализе лекарственных препаратов не требуется предварительного выделения азитромицина дигидрата и отделения сопутствующих веществ. Сущность методики состоит в разведении проб с последующим ВА определением азитромицина.
источник
ГОСТ 33681-2015
Продукты пищевые. Определение антибиотиков методом инверсионной вольтамперометрии (левомицетин, тетрациклин)
Купить ГОСТ 33681-2015 — бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее
Цена на этот документ пока неизвестна. Нажмите кнопку «Купить» и сделайте заказ, и мы пришлем вам цену.
Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО «ЦНТИ Нормоконтроль».
Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.
- Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
- Курьерская доставка (7 дней)
- Самовывоз из московского офиса
- Почта РФ
Распространяется на продукты пищевые (мясо, субпродукты, яйца, молоко и продукты его переработки) и устанавливает инверсионный вольтамперометрический метод определения массовой концентрации тетрациклина и левомицетина.
5 Требования к выполнению аналитических измерений
6 Аппаратура, материалы и реактивы
7 Условия выполнения измерений
8 Подготовка к выполнению измерений
11 Вычисление и оформление результатов анализа
12 Контроль точности результатов анализа
Приложение А (справочное) Результаты межлабораторных испытаний
Food products. Determination of antibiotics by the method of inversion voltammetry (Chloromycetin, tetracycline)
Чтобы бесплатно скачать этот документ в формате PDF, поддержите наш сайт и нажмите кнопку:
ЕВРАЗИЙСКИЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ
EURO-ASIAN COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION
Определение антибиотиков методом инверсионной вольтамперометрии (левомицетин, тетрациклин)
Евразийский совет по стандартизации, метрологии и сертификации
Евразийский совет по стандартизации, метрологии и сертификации (ЕАСС) представляет собой региональное объединение национальных органов по стандартизации государств, входящих в Содружество Независимых Государств. В дальнейшем возможно вступление в ЕАСС национальных органов по стандартизации других государств.
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены».
1 ПОДГОТОВЛЕН Республиканским государственным предприятием «Казахстанский институт стандартизации и сертификации» и Межгосударственным техническим комитетом МТК 534 «Обеспечение безопасности сельскохозяйственной продукции и продовольственного сырья на основе принципов НАССР»
2 ВНЕСЕН Комитетом технического регулирования и метрологии Министерства по инвестициям и развитию Республики Казахстан
3 ПРИНЯТ Евразийским советом по стандартизации, метрологии и сертификации по результатам голосования в АИС МГС (протоколом от 12 ноября 2015 г. №82-П)
За принятие проголосовали:
Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004—97
Код страны по МК (ИСО 3166) 004—97
Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Минэкономики Республики Армения
Госстандарт Республики Беларусь
Госстандарт Республики Казахстан
Настоящий стандарт разработан на базе национального стандарта Республики Казахстан СТ РК 1505-2006 «Продукты пищевые. Определение антибиотиков методом инверсионной вольтамперометрии (левомицетин, тетрациклиновая группа)».
Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных (государственных) стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации.
В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация также будет опубликована в сети Интернет на сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге «Межгосударственные стандарты».
Исключительное право официального опубликования настоящего стандарта на территории указанных выше государств принадлежит национальным (государственным) органам по стандартизации этих государств.
После проведения анализа СУЭ хранить в сухом виде.
Подготовка к работе электрода сравнения
В качестве электрода сравнения используют хлорсеребряный электрод. Новый хлорсеребряный электрод сравнения заполняют насыщенным раствором хлорида калия, закрывают пробкой отверстие и выдерживают не менее 24 часов для установления равновесного значения потенциала. После проведения анализов электрод хранят, погрузив в насыщенный раствор хлорида калия.
Проверку работы индикаторного ртутно-пленочного электрода, СЭУ и электрода сравнения проводят в соответствии с 10.1.
8.4 Приготовление растворов
8.4.1 Приготовление фонового электролита
Раствором фонового электролита для левомицетина служит раствор
0,10 моль/дм 3 сульфата аммония (NH4)2S04. Для приготовления раствора на аналитических весах взвешивают навеску 13,20 г с точностью до 0,01 г сульфата аммония и помещают в мерную колбу вместимостью 1000,0 см 3 , растворяют вещество в небольшом количестве бидистиллированной воды и доводят бидистиллированной водой до метки.
Раствором фонового электролита для тетрациклина служит раствор
0,10 моль/дм 3 цитрата натрия.
8.4.2 Приготовление основного раствора левомицетина
Основным раствором (ОР) является рабочий стандартный раствор
левомицетина (рабочий стандартный образец) 1000,0 мг/дм 3 , приготовленный из сухого порошка левомицетина, удовлетворяющего требованиям [2], [3].
Основной раствор, содержащий 1000,0 мг/дм 3 левомицетина, готовят
следующим образом: на аналитических весах взвешивают навеску (0,1000±0,0001) г левомицетина, переносят в мерную колбу вместимостью 100,0 см 3 и доводят до метки этиловым спиртом.
Основной раствор левомицетина концентрации 1000,0 мг/дм 3 устойчив в течение трех месяцев при температуре от 2 °С до 5 °С.
8.4.3 Приготовление основного раствора тетрациклина
Основным раствором (ОР) является рабочий стандартный раствор
тетрациклина (рабочий стандартный образец) 1000,0 мг/дм 3 , приготовленный из сухого порошка тетрациклина, удовлетворяющего требованиям [2], [3].
Основной раствор, содержащий 1000,0 мг/дм 3 тетрациклина, готовят
следующим образом: на аналитических весах взвешивают навеску (0,1000±0,0001) г тетрациклина, переносят в мерную колбу вместимостью 100,0 см 3 и доводят до метки этиловым спиртом.
Основной раствор тетрациклина концентрации 1000,0 мг/дм 3 устойчив в течение трех месяцев при температуре от 2 °С до 5 °С.
Аттестованные смеси серий АС-1, АС-2, АС-3 АС-4, АС-5 с содержанием антибиотиков 100,0; 10,0; 5,0; 2,0 и 0,5 мг/дм 3 готовят соответствующим
разбавлением исходных растворов в мерных колбах или мерных пробирках этиловым спиртом, согласно Таблице 2.
Исходным раствором для приготовления АС-1 является основной раствор соответствующего антибиотика, для приготовления АС-2 исходным раствором является АС-1, для приготовления АС-3 исходным раствором является АС-2, для приготовления АС-4 исходным раствором является АС-3 и для АС-5 исходным раствором является АС-4 .
Таблица 2 — Приготовление аттестованных смесей
Концентрация исходного раствора для приготовления АС, мг/дм 3
Концентрация приготовленного раствора АС, мг/дм 3
Код полученного (АС) раствора антибиотика
АС-1 устойчива в течение 30 дней при хранении под темным колпаком в холодильнике при температуре от 2 °С до 5 °С;
АС-2 устойчива в течение 7 дней при хранении под темным колпаком в холодильнике при температуре от 2 °С до 5 °С;
АС-3, АС-4 и АС-5 устойчивы в течение одного дня.
При наличии государственного стандартного образца (ГСО) раствора определяемого вещества основные растворы готовят из соответствующего государственного стандартного образца (ГСО) в соответствии с инструкцией по приготовлению раствора.
8.4.4 Приготовление раствора хлорида калия концентрации 1,0 моль/дм 3
Навеску (7,46±0,01) г хлорида калия помещают в мерную колбу вместимостью
100,0 см 3 , растворяют в небольшом количестве бидистиллированной воды и доводят объем до метки бидистиллированной водой.
8.4.5 Приготовление раствора соляной кислоты
Раствор соляной кислоты концентрации 6,0 моль/дм 3 .
Соляную кислоту (квалификации х.ч.) перегоняют. Перегнанная при температуре 20 °С соляная кислота должна быть концентрации не менее 6,0 моль/дм 3 .
Раствор соляной кислоты концентрации 0,10 моль/дм 3 .
В мерную колбу вместимостью 1000 см 3 вносят небольшой объем (100 см 3 ) бидистиллированной воды, затем перегнанную соляную кислоту объемом 16,7 см 3 с концентрацией 6,0 моль/дм 3 , перемешивают и доводят до метки бидистиллированной водой.
В коническую колбу вместимостью 100 см 3 вносят 25,00 г молока или молочного продукта, взвешенного с точностью до 0,01 г, добавляют 1,0 см 3 соляной кислоты концентрации от 6 до 7 моль/дм 3 порциями по 0,2 см 3 . Смесь слегка перемешивают и оставляют на 15 минут, после чего разливают в центрифужные пробирки и центрифугируют 15 минут при скорости 6000 об/мин.
Центрифугат сливают в коническую колбу, помещают на водяную баню с температурой (35±5) °С и добавляют от 5 до 6 г сульфата аммония порциями от 2 до
3 г, каждый раз перемешивая содержимое колбы стеклянной палочкой до растворения соли.
Колбу с пробой выдерживают на водяной бане при указанной температуре в течение 20 минут, затем на 10 минут помещают в морозильную камеру холодильника.
После охлаждения содержимое колбы разливают в центрифужные пробирки, центрифугируют 15 минут при скорости 6000 об/мин. Центрифугат фильтруют в чистый стаканчик вместимостью 30 см 3 через двойной слой бумажного фильтра (синяя лента).
Полученный фильтрат является подготовленной пробой.
Для анализа берут аликвоту подготовленной пробы объемом 5,0 см 3 .
В коническую колбу вместимостью 200 см 3 вносят 25 г молока или молочного продукта, взвешенного с точностью до 0,01 г, добавляют 15,0 см 3 бидистиллированной воды и 0,5 см 3 концентрированной соляной кислоты. Смесь энергично встряхивают в течение 5 минут. Затем к смеси добавляют 1,5-2,0 г сульфата аммония (NH4)2S04 и 1,0 см 3 раствора ацетата цинка концентрацией
300,0 г/дм 3 , к полученной смеси прибавляют несколькими порциями от 0,5 до 1,0 г гидрокарбоната натрия до pH 6,0-6,5, контролируя pH раствора по индикаторной бумаге.
Смесь встряхивают в течение 5 минут (до прекращения интенсивного газовыделения). Полученную смесь переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют 10 минут при скорости 8000 об/мин.
Затем центрифугат отфильтровывают через бумажный фильтр в коническую колбу вместимостью 100 см, добавляют 1,0-1,1 г цитрата натрия и перемешивают до полного растворения.
Для анализа берут аликвоту полученного фильтрата подготовленной пробы объемом 10,0 см 3
В коническую колбу вместимостью 250 см 3 вносят навеску пробы гомогенизированного мяса или субпродуктов от 5,00 до 10,00 г, взятую с точностью до 0,01 г. Добавляют 5,0 см 3 этилового спирта и 20,0 см 3 раствора соляной кислоты концентрации 0,10 моль/дм 3 . Смесь встряхивают от 10 до 15 минут, переносят в пробирки для центрифугирования и центрифугируют в течение 15 минут при скорости вращения 6000 об/мин.
Затем центрифугат отфильтровывают через бумажный фильтр в коническую колбу вместимостью 100 см 3 . В колбу с фильтратом добавляют от 3,0 до 5,0 г сульфата аммония. Содержимое колбы встряхивают от 5 до 10 минут.
Полученную смесь переносят в пробирки для центрифугирования и центрифугируют в течение 15 минут при скорости вращения 6000 об/мин. Затем центрифугат отфильтровывают через бумажный фильтр в коническую колбу вместимостью 100 см 3 .
Для анализа берут аликвоту полученного фильтрата подготовленной пробы объемом от 1,0 до 5,0 см 3 (в зависимости от содержания левомицетина в продукте).
Содержимое из разбитого яйца помещают в любую посуду (стакан, чашку и т.п.), тщательно перемешивают и взбивают яйцо до однородной массы. В коническую колбу вместимостью 250 см 3 вносят навеску пробы гомогенизированного яйца от 5,0 до 10,0 г, взятую с точностью до 0,01 г.
Добавляют 5,0 см 3 этилового спирта и 20,0 см 3 раствора соляной кислоты концентрации 0,10 моль/дм 3 . Смесь встряхивают в течение от 10 до 15 минут, переносят в пробирки для центрифугирования и центрифугируют в течение 15 минут при скорости вращения 6000 об/мин.
Затем центрифугат отфильтровывают через бумажный фильтр в коническую колбу вместимостью 100 см 3 . В колбу с фильтратом добавляют от 3,0 до 5,0 г сульфата аммония. Содержимое колбы встряхивают от 5 до 10 минут.
Полученную смесь переносят в пробирки для центрифугирования и центрифугируют в течение 15 минут при скорости вращения 6000 об/мин. Затем центрифугат отфильтровывают через бумажный фильтр в коническую колбу вместимостью 100 см 3 .
Для анализа берут аликвоту полученного фильтрата подготовленной пробы объемом от 1,0 до 5,0 см 3 (в зависимости от содержания левомицетина в продукте).
При проведении анализов проб мяса, молока, яиц и продуктов их переработки для определения массовой концентрации антибиотиков методом ВА необходимо выполнять следующие операции на серийных полярографах (ПУ-1 и др.).
10.1.1 В приготовленный согласно 8.2 кварцевый стаканчик вместимостью от
15,0 до 25,0 см 3 с помощью пипетки вносят 10,0 см 3 фонового электролита. Стаканчик с полученным фоновым электролитом помещают в электрохимическую ячейку.
10.1.2 Опускают в раствор индикаторный электрод и электрод сравнения и подключают их к соответствующим клеммам прибора, устанавливают соответствующий потенциал от минус 0,45 до 0,05 В.
10.1.3 Устанавливают чувствительность прибора от 1-10′ 9 до 5-Ю’ 10 А/мм и включают режим дифференцирования.
10.1.4 Включают газ и проводят процесс электронакопления при потенциале минус 0,45 В или потенциале минус 0,05 В в течение 30 секунд при перемешивании раствора.
10.1.5 По окончании электролиза отключают газ и через 5 секунд начинают регистрацию вольтамперограммы в диапазоне потенциалов от минус 0,45 до минус 0,95 В или в диапазоне от плюс 0,20 до плюс 1,00 В. Потенциал катодного пика левомицетина находится в диапазоне (минус 0,65±0,05) В, тетрациклина — в диапазоне (0,75±0,05) В.
10.1.6 Останавливают потенциал при минус 0,95 В и проводят дорастворение примесей с поверхности электрода при перемешивании раствора в течение 10-15 секунд (для левомицетина).
10.1.7 Устанавливают потенциал 0,20 В и проводят дорастворение примесей с поверхности электрода при перемешивании раствора в течение 10-15 с (для тетрациклина).
10.1.8 Операции согласно 10.1.4-10 1.6 повторяют 2-3 раза.
При наличии на вольтамперограмме сигнала органического вещества менее 2 мм стаканчик, фоновый электролит и индикаторный электрод считают готовыми к проведению анализа. В противном случае проводят очистку электрода или стаканчика и повторяют операции в соответствии с 10.1.1-10.1.8.
10.1.10 Отключают электроды от прибора, вынимают стаканчик с раствором из ячейки или датчика и выливают содержимое стаканчика в сосуд для слива.
10.2.1 При определении левомицетина в стаканчик, подготовленный к проведению измерений в соответствии с 10.1, помещают 5 см 3 фонового электролита и аликвоту подготовленной пробы объемом 5 см 3 .
При определении тетрациклина в стаканчик, подготовленный к проведению измерений в соответствии с 10.1, помещают 10 см 3 анализируемой пробы, подготовленной к измерению по 9.2.
10.2.2 Помещают стаканчик с анализируемым раствором в электрохимическую ячейку или датчик.
10.2.3 Повторяют последовательно операции согласно 10.1.2-10.1.6.
10.2.4 Если высота катодного пика антибиотиков превышает 200 мм, то необходимо уменьшить чувствительность прибора. Если высота катодного пика вещества меньше 5 мм, то необходимо увеличить чувствительность прибора.
10.2.5 Операции согласно 10.1.4-10.1.6 повторяют три раза.
10.2.6 Измеряют высоты катодных пиков (левомицетин), анодных пиков (тетрациклин) определяемого вещества.
10.2.7 В стаканчик с анализируемым раствором с помощью пипетки или дозатора вносят добавку аттестованной смеси антибиотиков в таком объеме, чтобы высота пика на вольтамперной кривой увеличилась в два раза по сравнению с первоначальной. Добавку вносят в малом объеме, чтобы предотвратить изменение концентрации фонового раствора.
Рекомендуемые добавки аттестованных смесей известной концентрации и чувствительность прибора приведены в таблице 3.
Таблица 3- Рекомендуемые добавки аттестованных смесей
Диапазон определяемых концентраций, м кг/кг
Концентрация АС для добавок, мг/дм 3
Рекомендуемый объем добавки АС, см 3
Чувствительность прибора, А/мм
10.2.8 Проводят электронакопление и регистрацию вольтамперограмм по 10.1.4-10.1.6 три раза.
10.2.9 Измеряют высоты катодных (анодных) пиков антибиотиков в пробе с добавкой АС.
10.2.10 Выливают содержимое стаканчика в сосуд для слива.
10.2.11 Стаканчик промывают бидистиллированной водой, затем протирают влажным фильтром, добавив небольшое количество питьевой соды, промывают бидистиллированной водой и фоновым электролитом.
10.2.12 Операции согласно 10.2.1-10.2.11 проводят для каждой из параллельных анализируемых проб в одинаковых условиях.
10.2.13 При выполнении измерений по настоящему стандарту рекомендуется ведение записей условий анализа в рабочем журнале и регистрация вольтамперограммы на ленте самописца с указанием пробы и условий анализа согласно таблице 4.
Таблица 4 — Рекомендуемая форма записи результатов измерений при анализе проб
Анализируемая проба (характеристика, номер, дата)
Условия измерений (чувствительность; время электролиза; объем аликвоты)
Высота пика вещества в пробе, мм, или ток, А
Высота пика вещества после добавки АС, мм, или ток, А
Обработку результатов измерений аналитических сигналов — высот катодных пиков, анодных пиков — определяемого вещества и расчет массовых концентраций антибиотиков в пробах проводят следующим образом.
11.1.1 Для определяемого компонента рассчитывают среднее из трех значений высот пиков, полученных при трехкратной регистрации вольтамперограммы пробы, не учитывая первую вольтамперограмму.
По средней высоте катодного пика или анодного пика для данного вещества вычисляют значение катодного или анодного тока вещества по формуле
где /,— величина максимального катодного или анодного тока данного вещества в данной пробе, А; hi — средняя высота пика вещества в пробе, мм; а — чувствительность прибора при регистрации данного пика, А/мм.
Такой расчет проводят для вольтамперных кривых при регистрации анализируемой пробы (/=1) и пробы с добавкой (/=2) аттестованной смеси вещества.
11.1.3 Если регистрация вольтамперограмм пробы и пробы с добавками проводится без изменения чувствительности прибора, то операции согласно 11.1.2 можно не проводить, используя в дальнейших расчетах величины высот пиков вместо токов пиков.
11.2.1 Расчет содержания антибиотиков в анализируемой пробе проводят по формуле
гдеХ’- содержание антибиотика в анализируемой пробе, мкг/кг;
Сд — концентрация аттестованной смеси (АС) антибиотика, из которой делается добавка к анализируемой пробе, мкг/кг;
Уд — объем добавки АС антибиотика, см 3 ;
U — величина максимального катодного или анодного тока антибиотика в анализируемой пробе, А;
/г — величина максимального катодного или анодного тока в пробе с добавкой АС антибиотика, А; т — масса анализируемого продукта, г;
Уф — суммарный объем анализируемой смеси (фильтрата), см 3 ;
Уап— объем аликвоты пробы, взятой для анализа, см 3 .
11.2.2 Аналогичные вычисления проводят согласно 11.1.1-11.2.1 для второй параллельной анализируемой пробы. Получают соответственно значения X”.
11.2.3 Результаты измерений и вычислений рекомендуется оформлять записью в журнале по форме, приведенной в таблице 5.
Т аблицаб — Рекомендуемая форма записи результатов анализа проб
Номер параллельного определения
Содержание вещества в каждой из параллельных проб
Среднее содержание вещества в пробе
11.2.4 Таким образом, по двум параллельным определениям получают два значения концентрации X’ и X». Далее рассчитывают среднее арифметическое по формуле
За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое значение двух параллельных определений с тем же числом значащих цифр.
Если расхождение между результатами параллельных определений не превышает 1Х-Х”| 2 + (ДХ) 2 , (4)
при проведении внешнего контроля (Р=0,95):
где ДХ1и Дх — значения характеристики погрешности, соответствующие массовой концентрации левомицетина (или тетрациклина) в пробе с добавкой стандартных растворов и в реальной пробе соответственно;
Общее среднее значение испытываемой характеристики (т)
Среднее квадратическое отклонение сходимости (Sr)
Среднее квадратическое отклонение воспроизводимости (SR)
5 Требования к выполнению аналитических измерений. 4
6 Аппаратура, материалы и реактивы. 4
7 Условия выполнения измерений. 6
8 Подготовка к выполнению измерений. 6
10 Выполнение измерений. 11
11 Вычисление и оформление результатов анализа. 13
12 Контроль точности результатов анализа. 15
Приложение А (справочное) Результаты межлабораторных испытаний. 17
[1] ВФС 42991-2003 Фармакопейная статья [2] ВФС 609-2002 Фармакопейная статьяОпределение антибиотиков методом инверсионной вольтамперометрии (левомицетин, тетрациклин)
Determination of antibiotics by the method of inversion voltammetry (Chloromycetin,
Настоящий стандарт распространяется на продукты пищевые (мясо, субпродукты, яйца, молоко и продукты его переработки) и устанавливает инверсионный вольтамперометрический метод определения массовой концентрации тетрациклина и левомицетина.
Диапазон определяемых концентраций антибиотиков составляет в молоке от
3,0 до 30,0 мкг/кг, в яйце, мясе, субпродуктах убойных животных от 0,006 до 0,100 мг/кг.
Если содержание вещества в пробе выходит за верхнюю границу диапазона содержания определяемых веществ в аттестованных смесях, допускается разбавление (до двух раз) подготовленной к измерению пробы.
Примечание — Качественное определение(обнаружение) антибиотиков в пищевых продуктах, основанное на подавлении антибиотиком дегидрогеназной активности тест-культур в жидкой питательной среде, проводится по ГОСТ 31903.
Для применения настоящего стандарта необходимы следующие ссылочные нормативные документы:
ГОСТ ISO 5725-2003 (части 1-6) Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений
ГОСТ 8.315-97 Государственная система обеспечения единства измерений. Стандартные образцы состава и свойств веществ и материалов. Основные положения
ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты Издание официальное
ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание
ГОСТ 427-75 Линейки измерительные металлические. Технические условия
ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия;
ГОСТ 2156-76 Натрий двууглекислый. Технические условия;
ГОСТ 2405-88 Манометры, вакуумметры, мановакуумметры, напоромеры, тягомеры и тягонапоромеры. Общие технические условия;
ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия
ГОСТ 3769-78 Реактивы. Аммоний сернокислый. Технические условия;
ГОСТ 5381-93 (ISO 5019-1:1984, ISO 5019-2:1984, ISO 5019-5:1984) Изделия высокоогнеупорные хромитопериклазовые. Технические условия;
ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия;
ГОСТ 7269-79 Мясо. Методы отбора образцов и органолептические методы определения свежести;
ГОСТ 7702.0-74 Мясо птицы. Методы отбора образцов. Органолептические методы оценки качества;
ГОСТ 9293-74 (ISO 2435:1973) Азот газообразный и жидкий. Технические условия;
ГОСТ 9792-73. Колбасные изделия и продукты из свинины, баранины, говядины и мяса других видов убойных животных и птиц. Правила приемки и методы отбора проб;
ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия;
ГОСТ 14261-77 Кислота соляная особой чистоты. Технические условия;
ГОСТ 15150-69 Машины, приборы и другие технические изделия. Исполнения для различных климатических районов. Категории, условия эксплуатации, хранения и транспортирования в части воздействия климатических факторов внешней среды;
ГОСТ 18300-87 Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия;
ГОСТ 21400-75 Стекло химико-лабораторное. Технические требования. Методы испытаний;
ГОСТ 22280-76. Реактивы. Натрий лимоннокислый 5,5-водный. Технические условия;
ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования;
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры;
ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу;
ГОСТ 27583-88. Яйца куриные пищевые. Технические условия;
ГОСТ 29225-91 (ISO 1775:1975) Посуда и оборудование фарфоровые лабораторные. Общие требования и методы испытаний;
ГОСТ 29227-91 (ISO 835:2007) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования;
ГОСТ 31903-2012 Продукты пищевые. Экспресс-метод определения антибиотиков.
Примечание- При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов на территории государства по соответствующему указателю стандартов, составленному по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим
информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный документ заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться замененным (измененным) стандартом. Если ссылочный документ отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3.1 Отбор и подготовку лабораторной пробы к испытаниям проводят в соответствии с нормативным документом на испытуемый вид продукции: молоко и молочные продукты — по ГОСТ 26809; мясо и мясные продукты — по ГОСТ 7269; мясо птицы — по ГОСТ 7702.0.
3.2 Из объединенной лабораторной пробы для испытания отбирают две параллельные навески.
3.3 Пробы анализируют в течение рабочего дня, так как антибиотики со временем разлагаются (происходит уменьшение их концентрации).
3.4 Пробы хранят в холодильнике при температуре от 2 °С до 5 °С в сосудах из химического стекла под темным колпаком.
Сущность метода состоит в переводе левомицетина и тетрациклина из пробы в раствор, кислотном гидролизе и осаждении белка из гидролизата с последующим дифференциально-вольтамперометрическим (ВА) определением антибиотиков: левомицетина, тетрациклина.
Метод измерения основан на способности левомицетина восстанавливаться на индикаторном ртутно-пленочном электроде в фоновом электролите — 0,10 моль/дм 1 растворе сульфата аммония (NN4)2804 в области потенциалов от минус 0,45 до минус 0,95 В, тетрациклина — окисляться на индикаторном стеклоуглеродном электроде в фоновом электролите — 0,1 моль/дм 1 растворе цитрата натрия в области потенциалов от 0,65 до 0,85 В. Содержание антибиотиков определяют по высоте пика, регистрируемого при потенциале левомицетина — (минус 0,65±0,05) В, при потенциале тетрациклина — (0,75±0,05) В относительно хлорсеребряного электрода в дифференциальном режиме съемки вольтамперограмм. Массовую концентрацию антибиотиков в пробе определяют методом добавок аттестованных смесей левомицетина и тетрациклина. В качестве стандартных калибровочных образцов используют серийные лекарственные вещества левомицетин и тетрациклина гидрохлорид, соответствующие требованиям [1], [2].
5 Требования к выполнению аналитических измерений
5.1 Условия безопасного проведения работ
5.1.1 При выполнении аналитических измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007.
5.1.2 Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12 1.019.
5.1.3 Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009
5.1.4 Металлическую ртуть (не более 1,0 см 3 ) хранят под слоем воды в бюксе, помещенном в толстостенную склянку.
5.1.5 Необходимо иметь средства сбора и нейтрализации ртути (амальгамированную медную пластинку, раствор хлорного железа).
5.2 Требования к квалификации операторов
Выполнение измерений производятся лаборантом или химиком-аналитиком, владеющим техникой вольтамперометрического анализа и изучившим инструкцию по эксплуатации используемой аппаратуры.
6 Аппаратура, материалы и реактивы
При проведении количественного химического анализа применяют следующие средства измерений, вспомогательное оборудование, посуду, материалы и реактивы.
6.1 Средства измерений и вспомогательное оборудование
Серийный полярограф с дифференциальным режимом записи вольтамперограмм (ПУ-1 или другой) в комплекте с двухкоординатным самописцем и цифровым вольтметром типа Ф-203;
или анализатор вольтамперометрический СТА по действующим нормативным документам в комплекте с IBM-совместимым компьютером;
или анализатор вольтамперометрический ТА-2 по действующим нормативным документам в комплекте с IBM-совместимым компьютером.
Допускается использовать другое оборудование и приборы, позволяющие воспроизводить метрологические характеристики, указанные в данном стандарте.
Электрохимическая ячейка или электрохимический датчик, в состав которого входят:
— индикаторный ртутно-пленочный электрод (РЭП) с рабочей поверхностью от 15 до 20 мм 2 ;
— индикаторный стеклоуглеродный электрод (СУЭ) с рабочей поверхностью от 80 до 120 мм 2 ;
— сравнения хлорсеребряный электрод (ХСЭ) с сопротивлением не более 3,0 кОм;
сменные стаканчики из кварцевого стекла вместимостью от 15,0 до 25,0 см 3 ;
трубка для подвода инертного газа с целью удаления растворенного кислорода и перемешивания раствора;
Редуктор по ГОСТ 5381 с манометром (250±1) атмосфер по ГОСТ 2405;
Весы лабораторные аналитические общего назначения с наибольшим пределом взвешивания 200 г, второго класса точности по ГОСТ 24104;
Дозаторы пипеточные емкостью от 0,01 до 1,00 см 3 или от 10 до 1000 мкл типа П1 или другого типа;
Аппарат для бидистилляции воды (стеклянный) АСД-4 по ГОСТ 15150;
Шланги полиэтиленовые для подвода газа к ячейке;
Центрифуга лабораторная марки ОПН-8.
Посуда и оборудование фарфоровые лабораторные — по ГОСТ 29225.
Посуда лабораторная стеклянная.
Пипетки градуированные — по ГОСТ 29227.
Пипетки мерные лабораторные стеклянные второго класса точности вместимостью 0,50; 1,00; 2,00; 5,00, 10,0 см 3 — по ГОСТ 29227.
Посуда и оборудование лабораторные стеклянные — по ГОСТ 25336 или посуда мерная лабораторная стеклянная второго класса точности — по ГОСТ 1770.
Колбы мерные вместимостью 25,0; 50,0, 100,0; 1000 см 3
Цилиндры вместимостью 10,0;25,0 см 3 .
Пробирки мерные вместимостью 10,0; 15,0 см 3 .
Кварцевые стаканчики вместимостью от 15,0 до 25,0 см 3 .
Пробирки для центрифугирования из стекла или пластмассовые вместимостью от 10,0 до 20,0 см 3
Колбы конические — по ГОСТ 25336, вместимостью 100,0 см 3 и 250,0 см 3 .
Левомицетин (сухой порошок с содержанием основного вещества не менее
Тетрациклина гидрохлорид (сухой порошок с содержанием основного вещества не менее 98,5 %), соответствующий [3].
Спирт этиловый высшей очистки — по ГОСТ 18300.
Кислота соляная концентрированная — по ГОСТ 14261 осч или по ГОСТ 3118.
Калия хлорид — по действующим нормативным документам.
Азот газообразный — по ГОСТ 9293 или другой инертный газ (аргон, гелий) с содержанием кислорода не более 0,03 %.
Вода бидистиллированная по действующим нормативным документам или дистиллированная — по ГОСТ 6709, перегнанная в присутствии серной кислоты
(0,5 см 3 концентрированной серной кислоты на 1,0 дм 3 дистиллированной воды и 3,0 см 3 раствора перманганата натрия, массовая доля 3 %).
Бумага индикаторная универсальная (pH от 1 до 14).
Бумага фильтровальная — по ГОСТ 12026 или фильтры обеззоленные (зеленая или синяя лента).
Все реактивы должны быть квалификации о.с.ч. (особой чистоты) или х.ч. (химически чистые).
7 Условия выполнения измерений
При выполнении анализов должны соблюдаться следующие условия: -температура окружающего воздуха (25±10) °С;
— атмосферное давление (760±60) мм рт. от. или (97±10) кПа;
— относительная влажность (65±15) %;
— частота переменного тока (50±5) Гц;
Конкретные условия регистрации аналитических сигналов определяемого вещества приведены в разделах 9, 10 настоящего стандарта.
8 Подготовка к выполнению измерений
8.1 Подготовка приборов к работе
Подготовку и проверку полярографа (ПУ-1 или другого), вольтамперометра, самописца, цифрового вольтметра производят в соответствии с инструкцией по эксплуатации и техническому описанию соответствующего прибора.
8.1.1 Устанавливают следующий режим работы серийного полярографа ПУ-1 в режиме дифференцирования, в соответствии с таблицей 1:
— двухэлектродная система измерений;
— постояннотоковый режим регистрации вольтамперограмм с последующим дифференцированием;
— катодная развертка потенциала.
Таблица 1- Рекомендуемый режим работы полярографа ПУ-1
Поляризующее напряжение для электронакопления антибиотиков, В
Потенциал начала регистрации вольтамперной кривой, В
Конечное напряжение развертки, В
Потенциал очистки (дорастворение) электрода, В
Скорость линейного изменения потенциала, мВ/с
Чувствительность прибора при регистрации вольтамперограммы (в зависимости от содержания вещества в анализируемой пробе и поверхности электрода), А/мм
8.2 Подготовка лабораторной посуды
Новую лабораторную стеклянную посуду, сменные наконечники дозаторов, пипетки промывают многократно бидистиллированной водой и высушивают. Сменные кварцевые стаканчики хранят, закрыв калькой, в сухом виде.
Проверку стаканчиков для анализа на чистоту проводят путем регистрации вольтамперограмм фонового электролита согласно 10.1 после многократного ополаскивания их бидистиллированной водой и фоновым электролитом.
Посуда считается чистой, если аналитические сигналы органического соединения в фоновом электролите равны или близки к нулю (не более 2 мм, при чувствительности прибора 5-10″ 10 А/мм).
8.3 Приготовление и проверка работы электродов
Подготовка индикаторного ртутно-пленочного электрода
Индикаторный ртутно-пленочный электрод представляет собой фторопластовый стержень с запрессованной серебряной проволокой диаметром 2,0 мм длиной от 9 до 10 мм, площадь поверхности составляет от 15,0 до 20,0 мм 2 (поставляется потребителю в готовом виде).
Для подготовки электрода к работе необходимо нанести на поверхность серебра пленку ртути толщиной от 8 до 10 мкм. Покрытие ртутью производят путем опускания рабочей части электрода (серебряной проволоки) в металлическую ртуть на время от 2 до 3 с, затем ртуть растирают фильтровальной бумагой для равномерного распределения по поверхности серебра. В том случае, если на конце серебряной проволоки «свисает» избыточное количество ртути в виде капли, ее необходимо удалить стряхиванием в бюкс с ртутью.
Электрод промывают бидистиллированной водой. Процедуру амальгамирования рабочей поверхности электрода повторяют при появлении незаамальгамированных участков на поверхности электрода. При образовании серого налета на поверхности, электрод протирают фильтровальной бумагой.
Индикаторные СУЭ поставляется потребителю в готовом виде. Перед регистрацией каждой вольтамперограммы следует проводить промывку индикаторного СУЭ бидистилированной водой, кратковременно погружать рабочую часть электрода на время от 2 до 3 с в этанол и полировать его поверхность с помощью фильтровальной бумаги.
источник
Вольтамперометрическое определение стрептомицина и левомицетина в лекарственных препаратах и пищевых продуктах
ФЕДОРЧУК ВИКТОРИЯ АНАТОЛЬЕВНА
СТРЕПТОМИЦИНА И ЛЕВОМИЦЕТИНА В
ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТАХ И ПИЩЕВЫХ
02.00.02 – аналитическая химия
диссертации на соискание ученой степени
кандидата химических наук
Работа выполнена на кафедре физической и аналитической химии Томского политехнического университета
Научный руководитель Кандидат химических наук, Слепченко Г. Б.
Официальные оппоненты Доктор химических наук, профессор Марьянов Б. М.
Кандидат химических наук, Джабарова Н. К.
Ведущая организация – Кубанский государственный университет, г. Краснодар
Защита диссертации состоится “26” декабря 2003 г. в 1630 часов на заседании диссертационного совета Д. 212.269.04 при Томском политехническом университете (634050, г. Томск, пр. Ленина, 30)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Томского политехнического университета по адресу: ул. Белинского, Автореферат разослан “ 26 ” ноября 2003 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук, доцент Гиндуллина Т. М.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. В связи с возрастающими требованиями к качеству выпускаемых лекарственных средств высокочувствительное и экспрессное определение антибиотиков составляет важную часть контроля лекарственных препаратов на соответствие фармакопейным или иным аналогичным стандартам. В то же время приобретает все большее значение проблема отрицательного влияния на здоровье человека остаточных количеств антибиотиков, присутствующих в пищевых продуктах. Встречающиеся в пище антибиотики могут иметь различное происхождение, чаще всего они попадают в продукты животноводства при использовании их для профилактики и лечения заболеваний домашних животных. Допустимые уровни содержания антибиотиков в продуктах питания регламентируются медико-биологическими требованиями и санитарными нормами качества. В соответствии с требованиями остаточные количества антибиотиков в молочных, мясных продуктах и яйце не должны превышать 0,5 и 0,01 мкг/г для стрептомицина и левомицетина соответственно. Такие низкие концентрации можно обнаружить только с помощью высокочувствительных современных методов.
Среди всех методов анализа антибиотиков в основном преобладают микробиологические, которые, как правило, не обладают достаточной чувствительностью и позволяют проводить лишь качественный или полуколичественный анализ.
Использование метода вольтамперометрии в контроле качества лекарственных препаратов и пищевых продуктов обусловлено простотой аппаратуры, техники измерений, высокой чувствительностью и экспрессностью.
Настоящая работа направлена на установление оптимальных условий вольтамперометрического определения стрептомицина и левомицетина с целью разработки экспрессных и высокочувствительных методик контроля антибиотиков в сложных по составу объектах.
Цель работы. Исследовать вольтамперометрическое поведение стрептомицина и левомицетина и разработать методики их количественного определения в лекарственных препаратах и некоторых пищевых продуктах.
Научная новизна.
Впервые показана способность антибиотиков стрептомицина и левомицетина восстанавливаться на ртутно-пленочном электроде и установлены условия проведения электродного процесса.
Впервые рассчитаны некоторые физико-химические параметры электродной реакции с участием стрептомицина (n, ks, n), имеющих аналитическое значение.
Впервые предложено математическое описание формы аналитического сигнала стрептомицина на ртутно-пленочном электроде с целью повышения разрешающей способности метода.
Впервые установлены условия и разработан алгоритм подготовки проб пищевых продуктов для последующего определения содержания остаточных количеств стрептомицина и левомицетина вольтамперометрическим методом.
Впервые разработаны методики количественного химического анализа проб лекарственных препаратов (таблетки, глазные капли, порошки для инъекций) и молочных продуктов на содержание стрептомицина и левомицетина методом вольтамперометрии с использованием ртутно пленочного электрода.
Методики определения левомицетина в лекарственных препаратах и молочных продуктах метрологически аттестованы, зарегистрированы в Федеральном Реестре МВИ и внедрены в ряде учреждений России и Украины.
Практическое значение. Разработанные методики определения содержания антибиотиков являются экспрессными и недорогими по сравнению с известными микробиологическими и могут быть использованы в техническом анализе лекарственных средств и для контроля качества готового продукта, а также воздушной зоны химико-фармацевтических предприятий.
Предложенные методики позволяют экспрессно (за 2-3 часа) определить остаточные количества стрептомицина и левомицетина в молоке. Это очень важно для эффективной работы контрольно-аналитических лабораторий.
Предложенный способ количественного определения антибиотиков может быть использован для разработки методик количественного химического анализа стрептомицина и левомицетина в биосистемах (кровь, моча и др.) для проведения фармакокинетических исследований.
На защиту выносятся следующие положения:
Влияние различных факторов (Еэ, э, рН, w, режима регистрации вольтамперограмм) на потенциал и величину тока восстановления антибиотиков.
Математическое описание формы аналитического сигнала стрептомицина.
Результаты по определению некоторых физико-химических параметров электродной реакции с участием стрептомицина (n, ks, n), имеющих аналитическое значение.
Методики количественного определения стрептомицина и левомицетина в лекарственных препаратах (глазные капли, таблетки, порошки для инъекций) и пищевых продуктах (молоко и молочные продукты).
Апробация работы. Основные результаты работы в период выполнения докладывались и обсуждались на российских конференциях и симпозиумах: симпозиуме “Теория электроаналитической химии и метод ИВА” (Томск, 2000);
VI конференции “Аналитика Сибири и Дальнего Востока»
всероссийской конференции “Актуальные проблемы аналитической химии” (Москва 2002);
научно-практической конференции “Химия и технология лекарственных препаратов и полупродуктов” (Новокузнецк, 2002);
региональной научно-практической конференции «Технология органических веществ и высокомолекулярных соединений»
(Томск 2003), а также на научных семинарах кафедры физической и аналитической химии Томского политехнического университета.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ, в том числе статьи в рецензируемых журналах, 3 статьи в трудах симпозиумов и конференций, 2 тезисов докладов и получен 1 патент на изобретение РФ.
Структура диссертации. Работа объемом 130 страниц компьютерного текста, включая 28 рисунков и 14 таблиц, состоит из введения, пяти глав, выводов и приложения. Список литературы содержит 148 библиографических названий работ отечественных и зарубежных авторов.
В первой главе представлен литературный обзор по физико – химическим методам исследования стрептомицина и левомицетина и описанию формы пиков в вольтамперометрии. На основании обзора формируются задачи исследования. Описание используемой аппаратуры, типов электродов, методики проведения эксперимента приведены во второй главе.
Третья глава посвящена установлению условий оптимизации электровосстановления стрептомицина и левомицетина. В четвертой главе приведены данные исследований природы тока и механизма восстановления стрептомицина методами циклической вольтамперометрии, вольтамперометрии с использованием вращающегося дискового электрода. Определены некоторые физико-химические параметры, представляющие теоретический и практический интерес. Изложению результатов опытов по оценке предела обнаружения и нижней границы определяемых содержаний антибиотиков, взаимного влияния веществ и разработке методик количественного определения стрептомицина и левомицетина в лекарственных препаратах и некоторых пищевых продуктах посвящена пятая глава. Анализ полученных экспериментальных данных приведен в обсуждении результатов. В заключении сделаны выводы. В приложении представлены свидетельства, программа метрологической аттестации и акты о внедрении результатов работы.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Выбор условий оптимизации вольтамперометрического определения стрептомицина и левомицетина С целью разработки методик вольтамперометрического анализа лекарственных препаратов и пищевых продуктов установлены условия их количественного определения.
В качестве индикаторного использовали ртутно – пленочный электрод.
С целью выбора оптимального фонового электролита использовали ряд веществ. Установлено, что при определении низких концентраций антибиотика лучшим фоновым электролитом является 0,01 М NaOH, на фоне которого регистрируются четко выраженные вольтамперограммы с хорошей воспроизводимостью, относительное стандартное отклонение (Sr) при этом не превышает 0,06. Линейная зависимость градуировочных графиков сохраняется в диапазоне концентраций стрептомицина 10-8 10-6 моль/л (0,05 1,50 мг/л) (рис. 1). При определении концентраций стрептомицина более чем 1*10-6 моль/л можно использовать и другие растворы электролитов: буфер Бриттона-Робинсона (рН 8 — 11), 0,1 М Na2HPO4, 0,05 М NaClO4, буфер Na2B4O7 – NaOH (рН 11), 0,1 М Na3PO4.
Для количественного определения левомицетина оптимальным фоновым электролитом является 0,1 М сульфат аммония (NH4)2SO4 (рис. 2), который одновременно является хорошим осадителем белковых примесей в пищевых продуктах. Линейность градуировочных графиков на указанных фонах сохраняется в диапазоне концентраций левомицетина 9,3*10-9 1,0*10 моль/л (3,0 30,0 мкг/л). Относительное стандартное отклонение для указанного диапазона концентраций изменяется от 0,20 до 0,08.
I, mkA I, mkA 2. 0.12 0. 1.5 0. 0. 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 C*106, M 0 2 4 C*108, M Рис. 1. Зависимость величины тока Рис. 2. Зависимость величины восстановления стрептомицина от тока восстановления концентрации на фонах: буфер левомицетина от концентрации Бриттона-Робинсона (1);
буфер Na2B4O7 – 0,1 М KCl (1);
Важным фактором при определении органических веществ является рН среды, который оказывает влияние не только на скорость электродного процесса, но и на его механизм. Зависимость потенциала катодного тока стрептомицина от рН представлена на рис. 3. Увеличение рН среды приводило к смещению потенциала в сторону более отрицательных значений, т. е. к затруднению процесса восстановления стрептомицина, что, по-видимому, связано с предшествующей -E,V протолитической реакцией 1. депротонизации протонированных форм стрептомицина.
1. 1. Рис. 3. Зависимость потенциала максимума катодного пика стрептомицина от рН. Фон: буфер 1. Бриттона-Робинсона;
0. 2 4 6 8 10 pH В водных растворах стрептомицин может существовать в форме заряженных трех-, двух- и одновалентных катионов (ВН33+, ВН22+, ВН+) в зависимости от рН среды. С увеличением рН возможен распад трехосновной BH33+ кислоты c образованием двухзарядных катионов, которые восстанавливаются при большем отрицательном значении потенциала:
ВН33+ ВН22+. При высоких значениях рН (более 9,2) разряду подвергаются двухзарядные ионы. Потенциал восстановления также смещается в отрицательную область значений. В очень щелочных растворах, рН которых более 9,8, затрудняется регистрация вольтамперограмм, поэтому в качестве оптимального значения рН для количественного определения стрептомицина в водных растворах рекомендуем использовать значения 9,0 9,5. Оптимальным значением рН при определении левомицетина является 4,5 5,0.
При регистрации вольтамперограмм стрептомицина и левомицетина оптимальными являются скорости изменения потенциала (w) соответственно 40 – 50 и 10 – 25 мВ/с. При более высоких скоростях чувствительность повышается, но при этом увеличивается остаточный ток, использование меньших скоростей существенно снижает величину катодных токов антибиотиков. Тангенс угла наклона градуировочных графиков стрептомицина максимален при дифференциально-импульсном режиме регистрации вольтамперограмм. Поэтому для количественного определения стрептомицина рекомендован вариант дифференциально-импульсной вольтамперометрии. Для записи вольтамперных кривых левомицетина также использовали дифференциальный режим, который позволяет регистрировать четкие и воспроизводимые пики.
Ток восстановления стрептомицина слабо зависит от потенциала предварительного электролиза. Величина тока достигает максимального значения в области потенциалов – 1,2 — 1,3 В на фоне 0,01 М NaOH.
Потенциал электрохимического накопления левомицетина составляет – 0,45 — 0,47 В. При потенциалах – 0,45 Еэл — 0,47 уменьшается величина тока востановления левомицетина, кроме того, при Еэл — 0,47 В возникает большой остаточный ток, связанный с выделением водорода в кислых растворах и уменьшается высота пика.
Время предварительного электролиза для диапазона концентраций антибиотиков 3,0 50,0 мкг/л не превышает 180 с, при этом зависимость величины тока востановления от концентрации линейна. При концентрации более 50,0 мкг/л наблюдается отклонение от линейности зависимости I — э, что, по-видимому, связано с полным насыщением поверхности электрода.
Сделана оценка предела обнаружения (Сmin) с использованием 3 критерия, и нижней границы определяемых содержаний (Сн), которые равны 3,2*10-11 7,510-11 моль/дм3 и 4,0*10-9 и 6,010-9 моль/дм3 для стрептомицина и левомицетина соответственно.
Использование оптимальных значений э и Еэ позволяет регистрировать вольтамперограммы стрептомицина и левомицетина с четко выраженным максимумом. Это приводит к повышению точности и разрешающей способности метода и позволяет экспрессно определять антибиотики на уровне 7,510-11 и 6,010-9 моль/л соответственно для стрептомицина и левомицетина, что на 2 – 3 порядка ниже по сравнению с известными методами, применяющимися в настоящее время при анализе антибиотиков в сложных по составу смесях.
Исследование электродных процессов восстановления стрептомицина При низких концентрациях деполяризатора на вольтамперограмме присутствует практически один пик восстановления стрептомицина, однако при увеличении концентрации антибиотика в растворе регистрируются два пика, близко расположенных друг к другу. Для разделения сложного пика на составляющие широко используют математический подход, при этом форму экспериментального пика описывают различными математическими функциями.
Сравнение экспериментальных наружных ветвей налагающихся пиков с тремя элементарными функциями (Гаусса, производной логисты и Коши) показало, что форма наружных ветвей практически точно описывается [ ( E Em )] функцией Гаусса:, i = I e где I – высота пика, Em – положение максимума, – полуширина полупика.
На рис. 4 изображен двойной пик стрептомицина после нормирования к единице по высоте и к нулю по потенциалу относительно первого пика. На рисунке дано разъяснение величин, используемых в последующих формулах.
A Рис. 4. Схематическое изображение i двойного пика стрептомицина с указанием обозначений, 0. используемых в тексте.
B Координаты выделенных точек: А E 0. (0, I1);
• G / K 2+ K 1- D K 1+ K 2 G (E1/2,2+, I1/2,2).
• 0. I1/ 2,1 I1/2, E1/ 2,1+ E1/ 2,2 Em1 E min E1/ 2,2+ Em 0 -100 0 100 E, mV С помощью уравнения Гаусса, найдены значения полуширины полупика наружных ветвей первого (1+) и второго (2-) пиков:
0. 1 0. 2 = 1+ = ln 2 = E 1, E1 E 1,1+,1+ 2 Полуширину полупиков внутренних ветвей рассчитали по формулам:
0. 0. 2+ =VE 1 = E 1 =, K 2+ K Значения коэффициентов К и приведены в таблице 1, из которой видно, что оба пика являются несимметричными, поэтому для описания контура двойного пика использована функция бигаусса (БГ), когда каждая ветвь описывается уравнением Гаусса со своим значением полуширины.
Значения К и для четырех ветвей двойного пика стрептомицина при четырех концентрациях (ССМ).
ССМ, мг/дм 0,5 4,0 10,0 16, Ветвь К К К К 1+ 0,0196 42,47 0,0193 43,14 0,0179 46,51 0,0179 46, 1- 0,0194 42,91 0,0181 46,01 0,0176 47,31 0,0176 47, 2+ 0,0236 35,28 0,0212 39,27 0,0204 40,81 0,0204 40, 2- 0,0224 37,17 0,0208 40,03 0,0186 44,76 0,0185 45, *) 1+ и 1- — положительная и отрицательная ветви первого пика;
2+ и 2- — то же для второго пика.
Уравнение суммарного БГ пика имеет вид:
E 0, 1+ -(1 E ) i1 = I1 e при E 0, E Em2, 2+ -[ 2 ( E E )] i2 = I 2 e при E Em2, i = i1 + i Контур пика, рассчитанный по уравнению БГ практически совпадает с экспериментальными данными.
Таким образом, предложенное нами уравнение БГ позволяет описывать форму аналитического сигнала стрептомицина на ртутно-пленочном электроде с целью его разделения на два самостоятельных пика. Этот прием мы использовали для дальнейшего изучения механизма электродного процесса стрептомицина.
Использование метода циклической вольтамперометрии показало, что при катодной развертке потенциала на циклических вольтамперограммах стрептомицина наблюдается четко выраженный аналитический сигнал. При анодном реверсе потенциала пик окисления стрептомицина выражен очень слабо, отношение величины анодного тока к катодному составляет 1/10, при этом разница между максимумами катодного и анодного пиков составляет менее 30 мВ.
Увеличение скорости вращения электрода приводило к возрастанию предельного тока стрептомицина, при этом наблюдалась тенденция к смещению аналитического сигнала относительно Еп. Зависимость величины предельного тока от 1/2 носит прямолинейный характер. Экстраполируя кривую I — 1/2 на ось ординат ( = 0), можно выделить часть тока, не зависящую от перемешивания и отвечающую нефарадеевскому процессу.
Поскольку таким процессом при электровосстановлении органических веществ является адсорбция, возникающая вследствие структурного взаимодействия адсорбата и адсорбента, то отрезок, отсекаемый прямой линией на оси ординат, соответствует величине тока электровосстановления адсорбированных молекул. Адсорбционная составляющая тока электровостановления стрептомицина составляет менее 20% суммарного тока.
На полулогарифмическом графике Е – ln ( I / Iпред – I ), имеется два прямолинейных участка. Рассчитанные эффективные коэффициенты переноса (n) имеют различные значения и изменяются по мере протекания электродного процесса от 0,8 до 0,62. Это указывает на сложный характер электровосстановления стрептомицина, протекающего, по-видимому, через стадию образования промежуточных продуктов реакции. Значение n также оценено из зависимостей I – lgw, I – Q и по точкам перегиба восходящей и нисходящей ветвей пика стрептомицина.
Из полулогарифмических зависимостей и значения n сделано предположение о числе электронов, принимающих участие в суммарном электродном процессе, которое равно 1,8 ± 0,2. Сделана оценка величины константы скорости ks на основе изменения величин Iп и Еп при различных значениях w. Значение ks составляет 10-7 см/с.
Таким образом, в целом электродный процесс не является чисто диффузионным и может быть осложнен как адсорбционными явлениями, так и предшествующими и последующими реакциями с участием органического вещества.
Применение метода катодной вольтамперометрии для определения стрептомицина и левомицетина в лекарственных препаратах и пищевых продуктах При разработке методик изучено влияние на аналитические сигналы антибиотиков ряда соединений и ионов, которые являются электрохимически активными и могут содержаться в исследуемых объектах. Показано, что стократные избытки анионов I-, Cl-, Br-, F-, PO43-;
катионов Na+, K+, Са2+, Zn2+, Cu2+, Fe3+, Fe2+, органических веществ: водорастворимых витаминов B1, B2, РР, фолиевой, аскорбиновой, никотиновой кислот, флавоноидов, полифенольных соединений и др. не изменяют характер вольтамперных кривых восстановления стрептомицина и левомицетина в установленных оптимальных условиях проведения электродного процесса.
Мешающее влияние оказывают белковые примеси. Основной белок молока – казеин – находится в пробе в виде растворимой в воде кальциевой соли. Составные компоненты растворимого белка прочно адсорбируются на поверхности электрода и участвуют в редокс-превращениях. Поэтому присутствие белков затрудняет электродные процессы, снижает чувствительность, воспроизводимость и точность анализа.
Для освобождения от белковых примесей использовали кислотный гидролиз 0,1 М HCl с последующим осаждением белка из гидролизата при рН 4,7 5,1, что соответствовало изоэлектрической точке белковых примесей.
Осадителями служили щавелевая кислота (при определении стрептомицина) и соль аммония сернокислого (при определении левомицетина). После отделения осадка центрифугированием проводили фильтрование раствора через бумажный фильтр с последующим вольтамперометрическим определением антибиотиков. Определение стрептомицина проводили в специальной двухкамерной ячейке, разделенной мембранным фильтром из химически и электрохимически инертного материала с диаметром пор 0,4 мкм.
На основании установленных оптимальных условий впервые разработаны экспрессные методики определения стрептомицина и левомицетина в лекарственных препаратах и в сложных по составу пищевых продуктах (молоко и молочные продукты) на уровне 6,810-9 моль/л (10, мкг/кг) для стрептомицина и 9,310-9 моль/л (3,0 мкг/кг) для левомицетина.
Количественное определение проводили методом добавок стандартного раствора. Время анализа одной пробы не превышает 10 – 15 минут при анализе лекарственных препаратов и 2 часов при анализе молока.
Правильность разработанных методик подтверждена методом введено найдено (табл. 2), при анализе лекарственных препаратов также проведением сравнительных проб спектрофотометрическим методом (табл. 3).
Результаты вольтамперометрического определения стрептомицина и левомицетина в молоке (Р = 0,95) Введено Найдено Определяемое № n (С ± ), мг/кг вещество пробы С, мг/кг 0,058 ± 0, 1 5 0, 0,098 ± 0, 2 7 0, 0,343 ± 0, Стрептомицин 3 7 0, 0,536 ± 0, 4 7 0, 1,037 ± 0, 5 6 1, 0,01 ± 0, 1 6 0, 0,012 ± 0, 2 5 0, 0,016 ± 0, Левомицетин 3 5 0, 0,033 ± 0, 4 7 0, 0,047 ± 0, 5 5 0, Таблица 3.
Сравнение результатов анализа левомицетина в лекарственных препаратах методами вольтамперометрии и спектрофотометрии (Р = 0,95) Вольтамперометрия Спектрофотометрия Объект анализа (С ± ), (С ± ), n n % масс % масс Глазные капли 0,249 ± 0,012 0,247 ± 0, левомицетина 7 0,25% 0,248 ± 0,010 0,246 ± 0, -«- 6 0,251 ± 0,010 0,253 ± 0, -«- 5 0,250 ± 0,015 0,247 ± 0, -«- 7 0,254 ± 0,012 0,251 ± 0, -«- 6 мг/1 таб Таблетки 250,64 ± 9,00 248,43 ± 10, левомицетина 7 250 мг 249,68 ±8,50 247,39 ± 9, -«- 5 Таблетки 498,59 ± 10,30 505,23 ± 10, левомицетина 6 500 мг 496,38 ± 9,50 495,45 ± 11, -«- 6 Таким образом, впервые установлены условия количественного определения стрептомицина и левомицетина на уровне наноконцентраций, которые защищены патентом на изобретение РФ. Разработаны методики количественного определения антибиотиков в лекарственных препаратах и молочных продуктах. Методики метрологически аттестованы, внесены в Федеральный Реестр МВИ и внедрены в ряде ветеринарных, санитарно эпидемиологических лабораторий и других учреждений России и Украины, что подтверждается свидетельствами о метрологической аттестации и актами о внедрении.
ВЫВОДЫ 1. Впервые установлены условия количественного определения стрептомицина и левомицетина методом вольтамперометрии с использованием ртутно пленочного электрода: состав фона 0,01 М NaOH (рН 9,0 – 9,5) и 0,1 М (NH4)2SO4;
Еэл – 1,2 — 1,3 и – 0,45 — 0,47 В;
w 40 50 и 10 25 мВ/с для стрептомицина и левомицетина соответственно.
2. Определены некоторые физико-химические параметры электродной реакции с участием стрептомицина: n = 1,8 ±0,2, n = 0,62 0,80, ks = 1*10-7 см/с, имеющих аналитическое значение.
3. Методами циклической вольтамперометрии, из полулогарифмических зависимостей установлено, что электровосстановление представляет собой диффузионный процесс, осложненный побочными процессами: как адсорбционными явлениями, так и предшествующими и последующими реакциями с участием органического вещества.
4. Впервые предложено математическое описание формы аналитического сигнала стрептомицина на ртутно-пленочном электроде с использованием уравнения бигаусса для несимметричных пиков, позволяющее разделять два пика и повышать разрешающую способность метода.
5. Сделана оценка предела обнаружения и нижней границы определяемых Сmin и Сн составляют соответственно 3,2*10-11 и содержаний. Значения 7,510-11 моль/дм3 для стрептомицина и 4,0*10-9 и 6,010-9 моль/дм3 для левомицетина.
6. Оценено мешающее влияние сопутствующих анионов, катионов, органических веществ (витаминов, флавоноидов, полифенольных и др.
соединений) на величину тока восстановления антибиотиков. Установлены условия устранения мешающего влияния белков пищевых продуктов на аналитический сигнал антибиотиков. Способ подготовки пробы и определения левомицетина в пищевых продуктах и лекарственных препаратах защищен патентом на изобретение РФ. Предложена двухкамерная ячейка для вольтамперометрического определения стрептомицина в молоке.
7. На основании установленных оптимальных условий разработаны методики количественного химического анализа проб лекарственных препаратов (таблетки, глазные капли и порошки для инъекций) и молочных продуктов на содержание стрептомицина и левомицетина методом вольтамперометрии с использованием ртутно-пленочного электрода на уровне 0,5 ПДК.
8. Методики количественного химического анализа левомицетина в лекарственных препаратах и молочных продуктах метрологически аттестованы, зарегистрированы в Федеральном Реестре МВИ, что подтверждается свидетельствами об аттестации и внедрены в ряде ветеринарных, санитарно-эпидемиологических лабораторий и других учреждений России и Украины что подтверждается шестью актами о внедрении.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНО В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:
1. Анисимова Л. С., Федорчук В. А., Пикула Н. П. Экспресс-определение левомицетина в лекарственных препаратах методом дифференциальной вольтамперометрии. // Вестник ТГУ, март 2000 г. с. 50 – 54.
2. Федорчук В. А., Анисимова Л. С., Скокшина И. В. Исследование и разработка методики определения левомицетина в лекарственных формах. // Материалы симпозиума «Теория электроаналитической химии и метод ИВА». Томск, 28 сент. – 1 окт. 2000 г. с. 258 – 260.
3. Анисимова Л. С., Слипченко В. Ф., Филичкина О. Г., Федорчук В. А.
Применение вольтамперометрии в анализе органических соединений. // Материалы VI конференции «Аналитика Сибири и Дальнего Востока».
Новосибирск, 21 – 24 ноября 2000 г. с. 63 – 64.
4. Анисимова Л. С., Слипченко В. Ф., Федорчук В. А. Способ количественного определения левомицетина в пищевых продуктах и фармпрепаратах. Патент РФ № 2180748 с приоритетом от 14.12.2000 г. Зарегистрирован в Гос.
реестре изобретений РФ 20.04.2002 г.
5. Слепченко Г. Б., Стромберг А. Г., Федорчук В. А.. Математическое описание формы вольтамперометрических аналитических пиков органических соединений на примере стрептомицина с помощью универсальной аппроксимационной формулы. // Материалы Всероссийской конференции «Актуальные проблемы аналитической химии». 11 – 15 марта 2002 г.
6. Федорчук В. А., Анисимова Л. С. Вольтамперометрическое определение стрептомицина в лекарственных препаратах. // Известия вузов. Химия и хим.
технология. 2002. Т. 45. № 3. С. 64 – 65.
7. Федорчук В. А., Анисимова Л. С. Определение стрептомицина в лекарственных препаратах методом вольтамперометрии. // Материалы научно-практической конференции «Химия и технология лекарственных препаратов и полупродуктов». г. Новокузнецк, 27 июня 2002 г. с. 177 – 181.
8. Федорчук В. А., Анисимова Л. С. Определение стрептомицина и левомицетина в пищевых продуктах методом вольтамперометрии. // Материалы региональной научно-практической конференции «Технология органических веществ и высокомолекулярных соединений». Г. Томск, 8 – октября 2003 г, с. 57 – 60.
источник