Определение левомицетина методом вэжх гост

«Определение остаточных количеств левомицетина (хлорамфеникола, хлормицетина) в продуктах животного происхождения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и иммуноферментного анализа. Методические указания. МУК 4.1.1912-04»

Документ по состоянию на август 2014 г.

Утверждаю
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации,
Первый заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
6 марта 2004 года

Дата введения —
1 мая 2004 года

1. Разработаны: ГУ НИИ питания РАМН (В.А. Тутельян, С.А. Хотимченко, С.А. Шевелева, В.К. Кирничная, Т.В. Киселева, Н.Г. Орлова, Н.Р. Ефимочкина, Н.В. Барбер), Московским государственным университетом им. М.В. Ломоносова (А.М. Егоров, А.Ю. Колосова, Ж.В. Самсонова).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Минздрава России.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г. Онищенко 6 марта 2004 г.

4. Введены в действие 1 мая 2004 г.

Настоящие Методические указания предназначены для учреждений госсанэпидслужбы Минздрава РФ и других ведомств, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов в соответствии с СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов».

Методические указания распространяются на методы с различным целевым назначением (арбитраж, скрининг). Два метода определения остаточных количеств левомицетина (хлорамфеникола, хлормицетина) в продуктах животного происхождения:

I — высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ);

II — иммуноферментного анализа (ИФА).

Среди ряда веществ, которые могут контаминировать продовольственное сырье и пищевые продукты, важное место занимают ветеринарные препараты, используемые как для лечения животных, так и в качестве стимуляторов роста. Сильнодействующими лекарственными препаратами, используемыми в ветеринарии, остаются антибиотики. Известно большое число антибиотиков, обладающих различными свойствами, механизмом и спектром действия, распределением в организме животных, характером метаболизма и т.д.

Систематическое поступление в организм человека антибиотиков с продуктами питания крайне вредно, поскольку они могут оказывать нежелательные эффекты, чаще всего в виде возникновения аллергических реакций, дисбактериозов, подавлять активность некоторых ферментов, изменять микрофлору кишечника, способствовать распространению устойчивых форм микроорганизмов и т.д. Следует учитывать возможность отрицательного влияния антибиотиков в сырье для пищевой промышленности на проведение ряда технологических процессов в переработке мяса, рыбы, молока (в частности, при получении кисломолочных продуктов) и других продуктов. Кроме того, наличие антибиотиков может затруднять бактериологические исследования качества продуктов животного происхождения.

Хлорамфеникол (далее — ХАФ) является антибиотиком широкого спектра действия, обладающим высокой активностью в отношении бактерий и риккетсий. В отличие от многих антибиотиков ХАФ обладает довольно простым химическим строением.

Хлорамфеникол малорастворим в воде, но хорошо в спирте. Установлено, что ХАФ медленно выводится из организма животных и сравнительно долго сохраняет свою активность при хранении продуктов.

В настоящее время для определения ХАФ в продуктах питания применяют ряд методов, в их числе микробиологические методы, которые являются сравнительно простыми и дешевыми, однако отличаются недостаточной специфичностью и воспроизводимостью результатов.

Для арбитражных исследований вводятся хроматографические методы, в частности ВЭЖХ, позволяющий раздельно определять как ХАФ, так и его метаболиты.

Количественный метод определения ХАФ при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии в сельскохозяйственных продуктах отличается низким пределом обнаружения (0,01 мг/кг), хорошей воспроизводимостью (относительное стандартное отклонение 0,15 — 0,21) и надежностью.

Для скрининговых целей в мире широко применяют методы иммунохимического анализа, обеспечивающие высокую чувствительность, специфичность и точность. Для контроля пищевой продукции предпочтение отдается методам твердофазного иммуноферментного анализа, которые являются высокочувствительными (предел обнаружения — 0,00008 мг/кг).

Методические указания предназначены для учреждений госсанэпидслужбы Минздрава РФ и других ведомств, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов. Согласно СанПиН 2.3.2.1078-01 содержание левомицетина в продуктах животного происхождения не допускается.

Отбор и подготовка проб аналогичны для обоих методов исследования.

Отбор продуктов питания осуществляется в соответствии с требованиями ГОСТов на исследуемые продукты: ГОСТ 7269-79 «Мясо», ГОСТ 7202.0-74 «Мясо птицы», ГОСТ 3622-68 «Молоко и молочные продукты».

Отобранные образцы продуктов герметично упаковывают в полиэтиленовые мешки, стеклянные банки с притертыми крышками или укладывают в коробки. Образцы доставляют в лабораторию для анализа сразу же после отбора проб или, в случае необходимости, хранят на холоде, а для скоропортящихся продуктов осуществляют замораживание -4 — -10 °С, используя для этой цели холодильники или соответствующие приспособления.

К исследованию скоропортящихся образцов следует приступать в день их доставки в лабораторию. При отсутствии такой возможности образцы должны хранить при указанной выше температуре не более двух недель со времени отбора среднего образца.

4. Определение остаточных количеств левомицетина (хлорамфеникола, хлормицетина) в продуктах животного происхождения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Метод основан на извлечении хлорамфеникола экстракцией этилацетатом, последовательной промывке экстракта разбавленным раствором щелочи и кислоты, обезжиривании петролейным эфиром и хроматографическом разделении с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии в обращенно-фазном варианте.

Помещение, в котором проводится определение хлорамфеникола, должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Все операции анализа необходимо проводить в вытяжном шкафу с использованием индивидуальных средств защиты.

4.4.1. Приготовление растворов

Взвешивают 25 мг левомицетина, помещают в мерную колбу на 25 куб. см и растворяют в метаноле, концентрация левомицетина 1 мг/мл. В мерную колбу на 25 куб. см помещают 0,25 куб. см полученного раствора и разбавляют метанолом до метки. Концентрация левомицетина в стандартном растворе 10 нг/мкл.

Для подтверждения наличия левомицетина к 50 мкл метанольного экстракта приливают 50 мкл 10%-ного раствора КОН и нагревают 20 мин. при 70 °С, 10 мкл полученного раствора вводят в тех же условиях в колонку жидкостного хроматографа. На полученной хроматограмме пик с временем удерживания левомицетина отсутствует. Это подтверждает наличие левомицетина в образце.

4.8.1. За окончательный результат измерения принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. Окончательный результат округляют до второго десятичного знака.

МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХЛОРАМФЕНИКОЛА В ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ (МОЛОКЕ, МЯСЕ, ЯЙЦАХ)

4.8.2. Если расхождение результатов двух параллельных определений (сходимость и воспроизводимость) превышает требования по п. 4.8.1, то повторно проводят два новых параллельных определения.

5. Определение хлорамфеникола (левомицетина) в продуктах животного происхождения (молоке, мясе, яйцах) методом иммуноферментного анализа

В основу метода количественного определения ХАФ в продуктах питания положен принцип твердофазного конкурентного ИФА на полистироловых планшетах. Принцип метода основан на конкуренции свободного ХАФ из измеряемой пробы и ХАФ, предварительно иммобилизованного на твердой фазе в составе белкового конъюгата, за центры связывания специфичных к ХАФ антител. После отделения несвязавшихся реагентов количество антител, прореагировавших с иммобилизованным антигеном, определяют с помощью антивидовых антител, меченных пероксидазой хрена. Количество связавшегося с антителами конъюгата вторичных антител выявляют с помощью субстрат-хромогенной смеси. Количество определяемого антибиотика, содержащегося в исследуемом образце, обратно пропорционально регистрируемой оптической плотности продукта ферментативной реакции.

Пределы обнаружения метода — 0,000012 — 0,00008 мг/кг.

5.3.2. Состав набора «Ридаскрин Левомицетин»

Микротитровальный планшет на 96 лунок (12 стрипов по 8 лунок), сенсибилизированных антителами «захвата» — 1 шт.

Комплект стандартных растворов левомицетина со следующими концентрациями: 0; 0,5; 1,5; 4,5; 13,5; 40,5 нг/куб. см в буферном растворе по 1,3 мл — 6 шт.

Конъюгат левомицетина с пероксидазой — 0,7 куб. см.

Антитела к левомицетину — 0,7 куб. см.

Субстрат, содержит пероксид карбамида — 7 куб. см.

Хромоген, содержит тетраметилбензидин — 7 куб. см.

Стоп-реагент, содержит 1 N серную кислоту — 14 куб. см.

Буфер 1, для разбавления стандартных растворов левомицетина, конъюгата, антител, растворов образцов и буфера 2 — 100 куб. см.

Буфер 2, для разбавления стандартных образцов при анализе молока — 1 куб. см.

Наборы рассчитаны на проведение анализа в 2-х повторностях 41 исследуемого образца и 6 калибровочных проб (всего 96 определений на один планшет).

5.3.3. Аналитические характеристики наборов

Специфичность. Использование высоко аффинных антител к ХАФ обеспечивает высокую специфичность анализа. Процент перекрестной реакции с сукцинатом ХАФ составляет 25%, с дезацилированным ХАФ, являющимся одним из метаболитов антибиотика, — менее 1%, с антибиотиками других групп — менее 1%.

Чувствительность. Минимальная концентрация ХАФ, определяемая с помощью набора, составляет 0,00008 мг/кг (куб. дм).

Воспроизводимость. Коэффициент вариации результатов определений концентраций ХАФ с помощью набора не превышает 12%.

Тест на открытие. Процент открытия составляет 70 — 130%.

Линейность. Линейность составляет 90 — 110%.

Диапазон определяемых концентраций 0,0001 — 0,1 мг/кг (куб. дм).

Проверка набора. При параллельном определении концентрации хлорамфеникола в продуктах питания животного происхождения с помощью набора ИФА-ХАФ и метода ВЭЖХ коэффициент корреляции составляет 0,975.

5.3.3.2. Набор «Ридаскрин Левомицетин»

Чувствительность (пределы обнаружения) — 0,000012 — 0,00005 мг/кг (куб. дм).

Перекрестная чувствительность: левомицетин — 100%, левомицетин основной — 0,5%, тиамфеникол — менее 0,05%. Нет чувствительности к тетрациклинам, гентамицину, ампициллину и флорфениколу.

Все компоненты наборов, за исключением о-фенилендиамина, в используемых концентрациях не токсичны. О-фенилендиамин обладает канцерогенным действием. Поэтому в случае попадания вещества на кожные или слизистые покровы следует немедленно тщательно смыть его большим количеством воды. Стоп-реагент содержит в своем составе серную кислоту. Следует избегать контакта стоп-реагента с кожей.

Все разведения реагентов и расчеты представлены для проведения анализа на 1 планшете.

Построение калибровочной кривой необходимо проводить для каждого планшета.

5.5.1. Приготовление реагентов

5.5.1.1. Приготовление фосфатно-солевого буфера, содержащего детергент (ФСБТ)

Содержимое двух флаконов с фосфатно-солевым буферным раствором количественно перенести в стакан и довести общий объем раствора до 400 куб. см дистиллированной водой. Полученный буфер может храниться закрытым в течение 5 дней при температуре не выше 2 — 8 °С.

5.5.1.2. Приготовление буфера 1

Содержимое флакона с концентратом буфера количественно перенести в стакан и довести общий объем раствора до 50 куб. см ФСБТ. Полученный буфер может храниться в течение 5 дней при температуре 2 — 8 °С.

5.5.1.3. Приготовление образцов для анализа

Молоко. Пробу молока развести перед анализом в 100 раз буфером 1.

Мясо. Встряхивают 3 г измельченной ткани (фарша) с 6 куб. см этилацетата в течение 5 мин., затем центрифугируют в течение 10 мин. Упаривают досуха 1 куб. см верхней фазы. Осадок перемешивают с 3 куб. см ФСБТ и центрифугируют при 3000 g в течение 5 мин. Супернатант отбирают и разводят в 50 раз ФСБТ.

Яйца. Взвешивают по 3 г смешанного (гомогенизированного) содержимого яйца в реакционную посуду и проводят дальнейшую пробоподготовку, как описано для образцов мяса.

5.5.1.4. Приготовление калибровочных проб (КП)

Калибровочные пробы готовятся заново при каждом определении.

Молоко. Калибровочные пробы готовятся из стандартного раствора ХАФ в метаноле (1 мг/куб. см) по следующей схеме.

1. Приготовить 5 куб. см раствора ХАФ в ФСБТ с концентрацией 0,01 мг/куб. см (5 куб. см раствора содержат 0,05 куб. см стандартного раствора ХАФ в метаноле).

2. Приготовить 1 куб. см калибровочной пробы 6 (КП 6) в буфере 1 с концентрацией 100 нг/куб. см (1 куб. см раствора содержит 0,01 куб. см раствора, приготовленного на стадии 1).

3. Последующие калибровочные пробы готовят по схеме из КП 6 с использованием буфера 1:

Мясо (яйца). Калибровочные пробы готовятся из стандартного раствора ХАФ в метаноле (1 мг/куб. см) по вышеприведенной схеме. На всех стадиях используется буфер ФСБТ.

5.5.1.5. Приготовление рабочего раствора антител

Рабочий раствор антител готовится непосредственно перед использованием.

Содержимое одного флакона с лиофилизированными антителами растворить в 6 куб. см ФСБТ. Полученный раствор хранению не подлежит.

5.5.1.6. Приготовление рабочего раствора конъюгата

Рабочий раствор конъюгата готовится непосредственно перед использованием.

Содержимое одного флакона с конъюгатом количественно перенести в стакан и довести общий объем до 15 куб. см ФСБТ — при анализе образцов молока и до 30 куб. см — при анализе образцов мяса и яиц. Полученный раствор хранению не подлежит.

5.5.1.7. Приготовление субстратно-хромогенной смеси

Субстратно-хромогенную смесь готовят непосредственно перед использованием.

Для приготовления раствора применять только химически чистую посуду.

В 11,25 куб. см дистиллированной воды растворить 1 таблетку о-фенилендиамина, тщательно перемешивая и избегая попаданий света. К полученному раствору количественно добавить 1,25 куб. см концентрата субстратного буферного раствора. Субстратно-хромогенная смесь, подготовленная к работе, хранению не подлежит.

Внесение реагентов следует проводить согласно схеме:

5.5.2.1. В два ряда лунок планшета внести калибровочные пробы (КП), приготовленные по п. 5.5.1.4, по 0,05 куб. см, начиная с минимальной концентрации. Рекомендуется не вносить калибровочные пробы в крайние ряды планшета во избежание влияния краевого эффекта. При разнице более 0,1 единицы оптической плотности в результатах параллельных проб на крайних рядах учитывать результат крайнего ряда не следует.

В оставшиеся лунки внести в дубликатах исследуемые образцы в объеме 0,05 куб. см.

Процедуру внесения образцов следует выполнять как можно быстрее. Вся операция не должна превышать 12 — 15 мин.

5.5.2.2. Во все лунки планшета внести по 0,05 куб. см рабочего раствора антител, приготовленного по п. 5.5.1.5. Антитела вносить в лунки планшета в той же последовательности, что и калибровочные пробы и исследуемые образцы.

5.5.2.3. Плотно закрыть планшет крышкой и выдержать при температуре 37 °С в течение 1,5 ч в термостате.

5.5.2.4. Содержимое лунок удалить стряхиванием. Затем провести отмывку. Для этого в каждую лунку планшета внести по 0,35 куб. см промывочного буферного раствора, оставить на 1 — 2 мин., а затем удалить содержимое лунок стряхиванием. Процедуру повторить 4 раза. После этого тщательно удалить остатки влаги из лунок, несколько раз вытряхнув планшет о марлевую салфетку или фильтровальную бумагу.

5.5.2.5. Во все лунки планшета внести по 0,1 куб. см рабочего раствора конъюгата, приготовленного по п. 5.5.1.6.

5.5.2.6. Плотно закрыть планшет крышкой и выдержать при температуре 37 °С в течение 1 ч в термостате.

5.5.2.7. Содержимое лунок удалить стряхиванием. Затем провести отмывку. Для этого в каждую лунку планшета внести по 0,35 куб. см промывочного буферного раствора, оставить на 1 — 2 мин., а затем удалить содержимое лунок стряхиванием. Процедуру повторить 5 раз. После этого тщательно удалить остатки влаги из лунок, несколько раз вытряхнув планшет о марлевую салфетку или фильтровальную бумагу.

5.5.2.8. Во все лунки планшета внести по 0,1 куб. см раствора субстратно-хромогенной смеси и выдержать планшет при комнатной температуре 18 — 25 °С в темном месте в течение 30 — 35 мин. при анализе образцов молока и 7 — 10 мин. — при анализе образцов мяса или яиц.

5.5.2.9. Внести во все лунки планшета по 0,35 куб. см стоп-реагента (раствора серной кислоты).

5.5.2.10. Измерить оптическую плотность в лунках планшета при длине волны 490 нм. Окраска планшета стабильна в течение 1 ч в темноте.

Построить калибровочную кривую зависимости оптической плотности от концентрации ХАФ в калибровочных пробах (следует использовать логарифмический масштаб для оси абсцисс). Соединить кривой (по лекалу) полученные точки. Образец калибровочной кривой приведен ниже (не приводится).

Рассчитать средние арифметические значения показателей оптической плотности испытуемых образцов и по калибровочной кривой определить в них концентрацию ХАФ, учитывая фактор разбавления, который равен 100, для всех образцов.

5.5.4. Условия хранения и эксплуатации набора

Набор реагентов ИФА-ХАФ должен храниться при температуре 2 — 8 °С в течение всего срока годности. Допускается хранение набора при температуре до 25 °С не более 5 суток. Срок годности набора — 12 мес. Компоненты набора перед использованием необходимо выдержать при комнатной температуре 18 — 25 °С не менее 30 мин. Раствор антител, конъюгата и субстратно-хромогенная смесь хранению не подлежат. Промывочный буферный раствор может храниться после разведения при температуре 2 — 8 °С в течение 5 дней. При вскрытии и растворении лиофилизированных компонентов набора необходимо следить, чтобы на пробках не осталось сухого вещества.

Образцы, предназначенные для анализа, должны храниться в холодильнике, в темном месте.

Пробу молока объемом 5 куб. см охладить до 8 °С, перенести в стеклянную центрифужную пробирку, центрифугировать при 4 — 12 °С в течение 15 мин. при 3000 g. Удалить верхний слой жира и перенести аликвоту обезжиренного молока в новую чистую пробирку. Для анализа использовать 0,05 куб. см раствора на 1 лунку планшета. Фактор разбавления — 1. Предел обнаружения — 0,00005 мг/кг. Предел количественного обнаружения — 0,00015 мг/кг.

Примечание: для приготовления стандартных растворов для измерения проб молока использовать буфер 2.

5.6.1.2. Исследования сухого молока

Взвесить в центрифужной стеклянной пробирке 2 г сухого молока, добавить 10 куб. см дистиллированной воды и встряхивать пробирку до растворения пробы. Добавить в пробирку по 1 куб. см осадителя 1 и осадителя 2. Пробы тщательно перемешать на вортексе и центрифугировать при 4 — 12 °С в течение 10 мин. при 3000 g. Перед центрифугированием пробы охладить до 8 °С, перенести 3,6 куб. см супернатанта (что соответствует 0,6 г сухого молока) в чистую пробирку. Добавить в пробирку 6 куб. см этилацетата и экстрагировать встряхиванием в течение 10 мин. Центрифугировать при комнатной температуре (20 — 25 °С) в течение 10 мин. при 3000 g.

Перенести 4 куб. см эфирного экстракта (соответствует 0,4 г сухого молока) в новую чистую пробирку и испарить экстракт досуха при 60 °С в слабом токе азота. Растворить сухой остаток в 0,4 куб. см буфера 1 и тщательно перемешать на вортексе. Для анализа используют 0,05 куб. см раствора на 1 лунку планшета.

Гомогенизировать пробу массой не менее 100 г в гомогенизаторе. Взвесить в стеклянной центрифужной пробирке 3 г гомогената, смешать с 3 куб. см дистиллированной воды и добавить 6 куб. см этилацетата. Интенсивно встряхивать пробирку по оси «вверх-вниз» в течение 10 мин. Центрифугировать при комнатной температуре (20 — 25 °С) в течение 10 мин. при 3000 g.

Перенести 4 куб. см эфирного экстракта (соответствует 2 г пробы) в новую чистую пробирку и испарить экстракт досуха на микроиспарителе при 60 °С в слабом токе азота. Растворить сухой остаток в 1 куб. см смеси изооктана с хлороформом в соотношении 2:3 и тщательно перемешать на вортексе. Добавить к раствору 0,5 куб. см буфера 1 и интенсивно перемешивать на вортексе в течение 1 мин. Центрифугировать при комнатной температуре (20 — 25 °С) в течение 10 мин. при 3000 g или более высоком ускорении.

Для анализа использовать 0,05 куб. см раствора (водный верхний слой ) на 1 лунку планшета.

В случае образования пены или геля в межфазовой зоне при недостаточном объеме водной фазы поместить пробирку на 5 мин. в водяную баню при температуре 80 °С и затем еще раз центрифугировать.

Гомогенизировать пробу массой не менее 100 г смешанного содержимого яйца в гомогенизаторе. Взвесить в стеклянной центрифужной пробирке 2 г гомогената, смешать с 12 куб. см этилацетата. Интенсивно встряхивать пробирку по оси «вверх-вниз» в течение 10 мин. Центрифугировать при комнатной температуре (20 — 25 °С) в течение 10 мин. при 3000 g.

Перенести 6 куб. см эфирного экстракта (соответствует 1 г пробы) в новую чистую пробирку и испарить экстракт досуха при 60 °С в слабом токе азота. Растворить сухой остаток в 1 куб. см смеси изооктана с хлороформом в соотношении 2:3 и тщательно перемешать на вортексе.

Добавить к раствору 1 куб. см буфера 1 и интенсивно перемешивать на вортексе в течение одной минуты. Центрифугировать при комнатной температуре (20 — 25 °С) в течение 10 мин. при 3000 g или более высоком ускорении.

Для анализа использовать 0,05 куб. см раствора (водный верхний слой ) на лунку планшета.

В случае образования пены или геля в межфазной зоне при недостаточном объеме водной фазы поместить пробирку на 5 мин. в водяную баню при температуре 80 °С и затем еще раз отцентрифугировать.

5.6.2.1. Предварительная подготовка

Перед использованием набора довести температуру всех реагентов до комнатной температуры (20 — 25 °С). Немедленно после использования охладить все оставшиеся реагенты до температуры 2 — 8 °С.

В процессе выполнения анализа не допускать высыхания лунок планшета.

На всех стадиях инкубации избегать воздействия прямого солнечного света. При инкубации планшета закрыть его непрозрачным экраном.

5.6.2.2. Приготовление раствора конъюгата

Перед разбавлением концентрированного раствора конъюгата осторожно встряхнуть содержимое флакона. Для приготовления рабочего раствора конъюгата разбавить концентрат конъюгата буферным раствором 1, имеющимся в комплекте набора, в отношении 1:11 (например, смешать 0,2 куб. см концентрата конъюгата с 2 мл буфера — данного разведения достаточно для 4-х стрипов по 8 лунок).

5.6.2.3. Приготовление раствора антител

Перед разбавлением концентрата антител осторожно встряхнуть содержимое флакона. Для приготовления рабочего раствора антител разбавить концентрат буферным раствором 1, имеющимся в комплекте набора, в отношении 1:11 (например, смешать 0,2 куб. см концентрата антител с 2 куб. см буфера 1 — данного разведения достаточно для 4-х стрипов).

5.6.2.4. Приготовление буферного раствора 2 (только для проб молока)

Для приготовления готового буферного раствора 2, использующегося при исследовании проб молока, разбавить концентрат буфера 2 в 9 куб. см буферного раствора 1 и энергично перемешать с помощью встряхивателя типа «вортекс», периодически подогревая раствор до 40 °С. Мутность раствора не влияет на результат определения, однако осадок на дне флакона после перемешивания должен равномерно распределяться в объеме раствора.

5.6.2.5. Подготовка микротитровального планшета

Перед выполнением анализа из планшета следует извлечь необходимое количество стрипов.

Остальные стрипы следует тщательно упаковать в фольгированный пакет вместе с осушителем, закрыть застежку пакета и поместить на хранение при температуре 2 — 8 °С.

5.6.2.6. Приготовление стандартных растворов

Для приготовления рабочих стандартных растворов левомицетина концентрированные растворы, входящие в состав набора, следует разбавить буфером 1 (или буфером 2) в указанной пропорции. Для разбавления использовать только стеклянную посуду.

После разбавления тщательно перемешивать готовые растворы.

Для каждой серии исследований следует готовить свежие стандартные растворы.

При исследовании образцов молока для разведения стандартов использовать буферный раствор 2.

Вставить в рамку планшета стрипы (лунки) в количестве, необходимом для выполнения всех запланированных определений в двух повторностях. Записать координаты лунок, предназначенных для стандартных растворов и подготовленных исследуемых растворов. Пример формы записи приведен на рис. 1.

5.6.3.1. Добавить по 0,05 куб. см стандартных растворов и растворов исследуемых образцов в соответствующие пары лунок.

5.6.3.2. Добавить по 0,05 куб. см разбавленного раствора конъюгата в каждую лунку.

5.6.3.3. Добавить в каждую лунку по 0,05 куб. см готового разбавленного раствора антител. Перемешать вручную, избегая попадания смеси в соседние лунки, и оставить на инкубацию в течение 2 ч при комнатной температуре (20 — 25 °С).

5.6.3.4. Вылить жидкость из лунок, перевернуть рамку планшета и выбить капли жидкости, оставшиеся в лунках, путем энергичного троекратного постукивания рамки с лунками по столу, накрытому фильтровальной бумагой. Наполнить лунки 0,25 куб. см дистиллированной воды и снова вылить воду. Выбить капли воды, как описано выше. Повторить процедуру промывки лунок водой еще два раза.

5.6.3.5. Добавить по 0,05 куб. см раствора субстрата и по 0,05 куб. см раствора хромогена в каждую лунку. Перемешать вручную, соблюдая осторожность, и инкубировать при комнатной температуре (20 — 25 °С) в течение 30 мин. в темноте.

5.6.3.6. Добавить в каждую лунку по 0,1 куб. см раствора стоп-реагента и хорошо перемешать вручную. В течение 60 мин. после добавления стоп-реагента измерить оптическую плотность в каждой лунке при 450 нм (нулевое считывание по воздуху).

5.6.4. Определение количества левомицетина в исследованных пробах

Средние значения оптической плотности, измеренной в лунках со стандартными и исследуемыми растворами, делятся на среднее значение оптической плотности, измеренной в лунках с первым (нулевым) стандартом, результат умножается на 100. Таким образом, результат измерения оптической плотности выражается в процентах от оптической плотности лунки с нулевым стандартом, то есть:

По величинам относительного поглощения, вычисленным для стандартных растворов, и соответствующим значениям концентрации левомицетина в нг/кг строится калибровочная кривая в полулогарифмической системе координат. Калибровочная кривая должна быть почти линейна в диапазоне 50 — 1350 нг/кг (см. рис. 2).

Концентрация левомицетина в растворах исследуемых образцов в нг/кг (или нг/куб. дм) определяется по калибровочной кривой соответственно относительному поглощению, измеренному и вычисленному для этих растворов.

Для того чтобы вычислить концентрацию левомицетина в исследуемой исходной пробе, величину концентрации левомицетина, полученную по калибровочной кривой, следует умножить на соответствующий фактор разбавления (см. п. 5.5.1.1 — 5.5.1.4). Результат исследования выражают в мг/кг или мг/куб. дм.

При выполнении пробоподготовки по п. п. 5.5.1.3 и 5.5.1.4 холостые пробы могут показывать положительный результат на уровне 2-й стандартной пробы. При расчете концентрации левомицетина в исследуемых пробах рекомендуется учитывать фоновый сигнал с помощью постановки холостого опыта. Для этого в каждой серии анализов необходимо выполнять испарение 4 куб. см чистого этилацетата и далее следовать процедуре, описанной в п. 5.5.3. Измеренный фоновый сигнал далее следует вычитать на стадии обработки результатов.

5.7.1. За окончательный результат измерения принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. Окончательный результат округляют до второго десятичного знака.

МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХЛОРАМФЕНИКОЛА В ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ (МОЛОКЕ, МЯСЕ, ЯЙЦАХ)

5.7.2. Если расхождение результатов двух параллельных определений (сходимость и воспроизводимость) превышает требования по п. 5.6.1, то повторно проводят два новых параллельных определения.

источник

ГОСТ 33526-2015 МОЛОКО И ПРОДУКТЫ ПЕРЕРАБОТКИ МОЛОКА. МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ АНТИБИОТИКОВ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Добавил: Богдан Кривошея

Дата: [18.10.2016]

ГОСТ 33526-2015 МОЛОКО И ПРОДУКТЫ ПЕРЕРАБОТКИ МОЛОКА. МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ АНТИБИОТИКОВ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Milk and dairy products. Method for determination of the antibiotic by high performance liquid chromatography

Дата введения — 1 июля 2016 г.

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены»

1 Разработан Федеральным государственным бюджетным научным учреждением «Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности» (ФГБНУ «ВНИМИ»)

2 Внесен Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстандарт)

3 Принят Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 12 ноября 2015 г. N 82-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97

Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97

Сокращенное наименование национального органа по стандартизации

Минэкономики Республики Армения

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 30 ноября 2015 г. N 2085-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 33526-2015 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2016 г.

Настоящий стандарт распространяется на молоко и продукты переработки молока (молоко (сырое, питьевое), сливки (сырые, питьевые), молочные продукты, молокосодержащие продукты, побочные продукты переработки молока, продукцию детского питания на молочной основе, сыр и сырные продукты, масло из коровьего молока и масляную пасту, консервы молочные, мороженое и смеси для мороженого и устанавливает метод высокоэффективной жидкостной хроматографии по определению остаточного содержания антибиотиков: левомицетина (хлорамфеникола), пенициллиновой группы, стрептомицина, тетрациклиновой группы.

Диапазон измерений массовых долей антибиотиков для левомицетина (хлорамфеникола) от 0,0001 млн -1 (мг/кг) до 1,0 млн -1 (мг/кг), для антибиотиков пенициллиновой и тетрациклиновой групп от 0,001 млн -1 (мг/кг) до 1,0 млн -1 (мг/кг), для стрептомицина от 0,005 млн -1 (мг/кг) до 1,0 млн -1 (мг/кг).

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ ИСО 5725-1-2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения*

ГОСТ ИСО 5725-6-2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике**

ГОСТ OIML R 76-1-2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты***

ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 12.4.021-75 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования

ГОСТ 245-76 Реактивы. Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный. Технические условия

ГОСТ 908-2004 Кислота лимонная моногидрат пищевая. Технические условия

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 2603-79 Реактивы. Ацетон. Технические условия

ГОСТ 5848-73 Реактивы. Кислота муравьиная. Технические условия

ГОСТ 6552-80 Реактивы. Кислота ортофосфорная. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия

ГОСТ 10652-73 Реактивы. Соль динатриевая этилендиамин-N,N, N’, N’-тетрауксусной кислоты, 2-водная (трилон Б). Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26809.1-2014 Молоко и молочная продукция. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу. Часть 1. Молоко, молочные, молочные составные и молокосодержащие продукты

ГОСТ 26809.2-2014 Молоко и молочная продукция. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу. Часть 2. Масло из коровьего молока, спреды, сыры и сырные продукты, плавленые сыры и плавленые сырные продукты

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов на территории государства по соответствующему указателю стандартов, составленному по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

Метод основан на экстракции антибиотиков из пробы продукта, очистке экстракта и определении антибиотиков в экстракте методом высокоэффективной жидкостной хроматографии со спектрофотометрическим детектированием.

Хроматограф для проведения ВЭЖХ, включающий следующие элементы:

— колонка хроматографическая обращенно-фазная (250·4,6) мм, заполненная силикагелем с диаметром частиц сорбента 3 мкм;

— детектор спектрофотометрический или диодно-матричный с длиной волны детектирования 265 нм и 280 нм с погрешностью задания длины волны ±1 нм;

— петлевое устройство для ввода пробы с рабочим объемом петли 0,020 см 3 ;

— регистрирующее устройство, позволяющее проводить измерения площади (или высоты) пика с погрешностью ±1%;

— программное обеспечение для статистической обработки полученных результатов измерений.

Устройство вакуумное для твердофазной экстракции.

Картридж для твердофазной экстракции объемом не более 6 см 3 , заполненный обращенно-фазным сорбентом с диаметром частиц не более 50 мкм.

Весы неавтоматического действия по ГОСТ OIML R 76-1 или весы по нормативным документам, действующим на территории государств, принявших стандарт, с пределом допускаемой абсолютной погрешности ±0,5 мг и ±1,0 мг.

Анализатор потенциометрический (рН-метр) с диапазоном измерения 1 — 14 ед. рН, с пределом допускаемой абсолютной погрешности ±0,01 ед. рН.

Центрифуга лабораторная с охлаждением, обеспечивающая скорость вращения не менее 15000 об/мин и диапазон температур охлаждения от 4°С до 20°С. с адаптерами для пробирок вместимостью 15 см 3 и микроцентрифужных пробирок вместимостью 1,5 см 3 .

Модуль термостатируемый нагревательный с системой отдувки растворителей инертным газом и максимальной температурой термостатирования 40°С.

Баня водяная термостатируемая.

Баня ультразвуковая с рабочей частотой не менее 20 Гц и объемом не менее 1 дм 3 .

Гомогенизатор роторный с четырехлопастным ножом, с угловой скоростью вращения ножей (1000 — 10000) мин -1 , включающий емкость вместимостью 1,0 дм 3 .

Встряхиватель лабораторный (вортекс) вибрационный для пробирок орбитального типа движения с амплитудой вращения гнезда 3 мм и скоростью вращения гнезда (150 — 2500) мин -1 .

Дозаторы механические переменного объема (0,1 — 3 мм 3 , 0,5 — 10 мм 3 , 20 — 200) мм 3 , 100 — 1000 мм 3 , 1 — 5 см 3 ) с наконечниками.

Колбы мерные 2-50-2, 2-100-2, 2-1000-2 по ГОСТ 1770.

Пипетки 1-1-1-5, 1-1-1-10 по ГОСТ 29227.

Пробирки мерные стеклянные П-1-10-0,1 ХС по ГОСТ 1770.

Цилиндр 1-25-1, 1-100-1, 1-250-2 по ГОСТ 1770.

Виалы (флаконы полипропиленовые) вместимостью 15 см 3 и 50 см 3 с герметично закрывающимися пластмассовыми крышками.

Колба Кн-1-250-24/29, Кн-1-500-24/29 ТС по ГОСТ 25336.

Стакан В-1-100, В-1-500, В-1-1000 ТС по ГОСТ 25336.

Воронка В-56-80 ХС по ГОСТ 25336.

Ступка фарфоровая с пестиком по ГОСТ 9147.

Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.

Фильтр нейлоновый с размером пор 0,45 мкм.

Бензилпенициллин, массовой долей основного вещества не менее 99%.

Демеклоциклин, массовой долей основного вещества не менее 90%.

Доксициклин, массовой долей основного вещества не менее 90%.

Кислота лимонная моногидрат пищевая по ГОСТ 908.

Кислота муравьиная по ГОСТ 5848, ч.д.а.

Кислота ортофосфорная по ГОСТ 6552. х.ч.

Метанол для хроматографии (метиловый спирт), х.ч.

Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный по ГОСТ 245. ч.д.а.

Окситетрациклина гидрохлорид, массовой долей основного вещества не менее 90%.

Соль динатриевая этилендиамин-N,N,N’ ,N’ — тетрауксусной кислоты 2-водная (трилон Б) по ГОСТ 10652, х.ч.

Стрептомицина сульфат, массовой долей основного вещества не менее 96%.

Тетрациклина гидрохлорид, массовой долей основного вещества не менее 90%.

Хлорамфеникол (левомицетин), массовой долей основного вещества не менее 99%.

Хлортетрациклин гидрохлорид, массовой долей основного вещества не менее 90%.

Феноксиметилпенициллин, массовой долей основного вещества не менее 99%.

Вода для лабораторного анализа деионизированная, с удельным сопротивлением 28 Ом, степень чистоты 2 по ISO 3696.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Допускается применение других средств измерения, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающим необходимую точность измерения, а также реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.

Отбор проб — по ГОСТ 26809.1, ГОСТ 26809.2, а также другим нормативным документам, действующим на территории государств, принявших стандарт.

Если определение не может быть проведено сразу после отбора проб, их хранят в холодильнике при температуре (4±2)°С не более 48 ч.

источник

ГОСТ 33526-2015 Молоко и продукты переработки молока. Методика определения содержания антибиотиков методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Текст ГОСТ 33526-2015 Молоко и продукты переработки молока. Методика определения содержания антибиотиков методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0—92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2—2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены»

1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным научным учреждением «Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности»

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстандарт)

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны

Сокращенное наименование национального

Минэкономики Республики Армения

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 30 ноября 2015 г. N9 2085-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 33526—2015 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2016 г.

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — е ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано е ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии е сети Интернет

В Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

МОЛОКО И ПРОДУКТЫ ПЕРЕРАБОТКИ МОЛОКА

Методика определения содержания антибиотиков методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Method tor determination ol the antibiotic by high performance liquid chromatography

Настоящий стандарт распространяется на молоко и продукты переработки молока (молоко (сырое. питьевое), сливки (сырые, питьевые), молочные продукты, молокосодержащие продукты, побочные продукты переработки молока, продукцию детского питания на молочной основе, сыр и сырные продукты, масло из коровьего молока и масляную пасту, консервы молочные, мороженое и смеси для мороженого и устанавливает метод высокоэффективной жидкостной хроматографии по определению остаточного содержания антибиотиков: левомицетина (хлорамфеникола), пенициллиновой группы, стрептомицина, тетрациклиновой группы.

Диапазон измерений массовых долей антибиотиков для левомицетина (хлорамфеникола) от 0.0001 млн 1 (мг/кг) до 1.0 млн 1 (мг/кг). для антибиотиков пенициллиновой и тетрациклиновой групп от 0.001 млн 1 (мг/кг) до 1.0 млн 1 (мг/кг). для стрептомицина от 0,005 млн 1 (мг/кг) до 1.0 млн 1 (мг/кг).

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ ИСО 5725-1—2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения 1

ГОСТ ИСО 5725-6—2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике 2

ГОСТ CiML R 76-1—2011 Государственная система обеспечения единства измерений. 8есы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 12.1.004—91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005—88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007—76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019—79 Система стандартов безопасности труда. Электробеэоласностъ. Общие требования и номенклатура видов защиты 3

ГОСТ 12.4.009—83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 12.4.021—75 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования

ГОСТ 245—76 Реактивы. Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-еодный. Технические условия

ГОСТ 908—2004 Кислота лимонная моногидрат пищевая. Технические условия

ГОСТ 1770—74 (ИСО 1042—83. ИСО 4786—80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры. мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

‘ На территорш Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-1—2002. 3 На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-6—2002. 9 На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 12.1.019—2009.

ГОСТ 2603—79 Реактивы. Ацетон. Технические условия ГОСТ 5848—73 Реактивы. Кислота муравьиная. Технические условия ГОСТ 6552—80 Реактивы. Кислота ортофосфорная. Технические условия ГОСТ 6709—72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9147—80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия ГОСТ 10652—73 Реактивы. Соль динатриевая этилендиамик-Ы.Г^М’.М’-тетрауксусной кислоты. 2-еодная (трилон Б). Технические условия

ГОСТ 12026—76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия ГОСТ 25336—82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Тилы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26809.1—2014 Молоко и молочная продукция. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу. Часть 1. Молоко, молочные, молочные составные и молокосодержащие продукты

ГОСТ 26809.2—2014 Молоко и молочная продукция. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу. Часть 2. Масло из коровьего молока, спреды, сыры и сырные продукты, плавленые сыры и плавленые сырные продукты

ГОСТ 29227—91 (ИСО 835-1—81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

4 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда и реактивы

Хроматограф для проведения ВЭЖХ. включающий следующие элементы:

— колонка хроматографическая обращенно-фазная (250 4.6) мм. заполненная силикагелем с диаметром частиц сорбента 3 мкм;

— детектор спектрофотометрический или диодно-матричный с длиной волны детектирования 265 нм и 280 нм с погрешностью задания длины волны 11 нм;

— петлевое устройство для ввода пробы с рабочим объемом петли 0.020 см э ;

— регистрирующее устройство, позволяющее проводить измерения площади (или высоты) пика с погрешностью ± 1 %;

— программное обеспечение для статистической обработки полученных результатов измерений. Устройство вакуумное для твердофазной экстракции.

Анализатор потенциометрический (pH-метр) с диапазоном измерения 1-14 ед. pH, с пределом допускаемой абсолютной погрешности ± 0.01 ед. pH.

Центрифуга лабораторная с охлаждением, обеспечивающая скорость вращения не менее 15000 об/мин и диапазон температур охлаждения от 4 в С до 20 в С. с адаптерами для пробирок вместимостью 15 см 3 и микроцентрифужных пробирок вместимостью 1.5 см 3 .

Модуль термостатируемый нагревательный с системой отдувки растворителей инертным газом и максимальной температурой термостатироаания 40 в С.

Баня водяная термостатируемая.

Баня ультразвуковая с рабочей частотой не менее 20 Гц и объемом не менее 1 дм 3 .

Гомогенизатор роторный с четырехлопастным ножом, с угловой скоростью вращения ножей (1000 — 10000) мин 1 . включающий емкость вместимостью 1.0 дм 3 .

Встряхиватель лабораторный (вортекс) вибрационный для пробирок орбитального типа движения с амплитудой вращения гнезда 3 мм и скоростью вращения гнезда (150 — 2500) мин \

Дозаторы механические переменного объема (0.1-3 мм 3 . 0,5-10 мм 3 . 20-200) мм 3 . 100-1000 мм 3 . 1-5 см 3 ) с наконечниками.

Колбы мерные 2-50-2,2-100-2. 2-1000-2 по ГОСТ 1770.

Пипетки М-1-5, 1-1-1-10 по ГОСТ 29227.

Пробирки мерные стеклянные П-1-10-0.1 ХС по ГОСТ 1770.

Цилиндр 1-25-1. 1-100-1. 1-250-2 лоГОСТ 1770.

Колба Кн-1-250-24/29, Кн-1-500-24/29 ТС по ГОСТ 25336.

Стакан В-1-100. В-1-500. В-1-1000 ТС по ГОСТ 25336.

Воронка В-56 50 ХС по ГОСТ 25336.

Ступка фарфоровая с пестиком по ГОСТ 9147.

Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.

Фильтр нейлоновый с размером пор 0.45 мкм.

Бекзилпенициллин. массовой долей основного вещества не менее 99 %.

Демеклоциклин. массовой долей основного вещества не менее 90 %.

Доксициклин, массовой долей основного вещества не менее 90 %.

Кислота лимонная моногидрат пищевая по ГОСТ 908.

Кислота муравьиная по ГОСТ 5548. ч.д.а.

Кислота ортофосфорная по ГОСТ 6552. х.ч.

Метанол для хроматографии (метиловый спирт), х.ч.

Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-еодный по ГОСТ 245. ч.д.а.

Окситетрациклина гидрохлорид, массовой долей основного вещества не менее 90 %.

Соль динатриевая этилвндиамин-М.М.М.Ы’-тетраухсУсной кислоты 2-водная (трилон Б) по ГОСТ 10652. х.ч.

Стрептомицина сульфат, массовой долей основного вещества не менее 96 %.

Тетрациклина гидрохлорид, массовой долей основного вещества не менее 90 %. Хлорамфеникол (левомицетин), массовой долей основного вещества не менее 99 %. Хлортетрациклин гидрохлорид, массовой долей основного вещества не менее 90 %. Феноксиметилпенициллин. массовой долей основного вещества не менее 99 %.

Вода для лабораторного анализа деионизированная, с удельным сопротивлением 28 Ом. степень чистоты 2 по ISO 3696.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Если определение не может быть проведено сразу после отбора проб, их хранят в холодильнике при температуре (4 ± 2) ®С не более 48 ч.

6 Подготовка к проведению измерений

6.1 Приготовление растворов

6.1.1 Приготовление раствора лимонной кислоты молярной концентрации с (С₆Н_в₇ Н₂0)* 0,1 моль/дм 3

В мерную колбу вместимостью 1000 см 3 помещают (21,000 ± 0.001) г лимонной кислоты, растворяют в небольшом количестве деионизированной воды и тщательно перемешивают. Объем раствора доводят деионизированной водой до метки.

Раствор хранят при температуре (20 ± 2) *С не более 1 мес.

6.1.2 Приготовление раствора натрия фосфорнокислого молярной концентрации с (ЫаНгРО* 2НгО) * 0,2 моль/дм 3

В мерную колбу вместимостью 1000 см 3 вносят (35.600 ± 0.001) г натрия фосфорнокислого, растворяют в небольшом количестве деионизированной воды и тщательно перемешивают. Объем раствора доводят деионизированной водой до метки.

Раствор хранят при температуре (20 ± 2) *С не более 1 мес.

6.1.3 Приготовление буферного раствора

В конической колбе вместимостью 250 см 3 смешивают 60 см 3 раствора лимонной кислоты молярной концентрации 0.1 моль/дм 3 (6.1.1) и 40 см 3 раствора натрия фосфорнокислого молярной концентрации 0.2 моль/дм 3 (6.1.2). добавляют (37.200 ± 0,001) г трилона Б. аккуратно перемешивают и измеряют значение pH полученного раствора. Значение pH должно составлять 4,0. При необходимости значение pH доводят до 4.0 ед.рН ортофосфорной кислотой.

Раствор хранят при температуре (20 ± 2) *С не более 1 мес.

6.1.4 Приготовление растворов элюентов мобильной фазы А и Б

6.1.4.1 Для приготовления раствора элюента мобильной фазы А в мерную колбу вместимостью 1000 см 3 помещают 200 см 3 деионизированной воды, добавляют 5 см 3 муравьиной кислоты и тщательно перемешивают. Объем раствора доводят деионизированной водой до метки, фильтруют через нейлоновый фильтр.

Раствор хранят при температуре (2012) °С не более 1 мес.

6.1.4.2 Для приготовления раствора элюента мобильной фазы Б в мерную колбу вместимостью 1000 см 3 помещают 200 см 3 метанола, добавляют 5 см 3 муравьиной кислоты и тщательно перемешивают. Объем раствора доводят метанолом до метки, фильтруют через нейлоновый фильтр.

Раствор хранят при температуре (20 ± 2) *С не более 1 мес.

6.1.5 Приготовление 50 %-ного раствора метанола

В мерную колбу вместимостью 50 см 3 помещают 25,0 см 3 метанола, добавляют небольшое количество деионизированной воды и тщательно перемешивают. Объем раствора доводят деионизированной водой до метки. Колбу помещают на ультразвуковую баню на 5 мин.

Срок хранения раствора в темной посуде при температуре (4 ± 2) *С — не более 1 мес.

6.1.6 Приготовление градуировочных растворов

6.1.6.1 Приготовление основных градуировочных растворов

6.1.6.1.1 В мерную пробирку вместимостью 10 см 3 помещают по 10 мг доксициклина. окситетра-циклина гидрохлорида, тетрациклина гидрохлорида и хпортетрациклина гидрохлорида, взвешенных с точностью до 0.5 мг. Добавляют 5 см 3 метанола и помещают в ультразвуковую баню на 1 мин. Объем полученного раствора доводят метанолом до метки.

6.1.6.1.2 В мерную пробирку вместимостью 10 см 3 помещают 10 мг стрептомицина сульфата, взвешенного с точностью до 0,5 мг. Добавляют 5 см 3 метанола и помещают в ультразвуковую баню на 1 мин. Объем полученного раствора доводят метанолом до метки.

6.1.6.1.3 В мерную пробирку вместимостью 10 см 3 помещают 10 мг хлорамфеникола (левоми-цитина). взвешенного с точностью до 0.5 мг. Добавляют 5 см 3 метанола и помещают в ультразвуковую баню на 1 мин. Объем полученного раствора доводят метанолом до метки.

6.1.6.1.4 8 мерную пробирку вместимостью 10 см 3 помещают по 10 мг феноксиметилпекицил-лина. бензилпенициллина. взвешенных с точностью до 0.5 мг. Добавляют 5 см 3 метанола и помещают в ультразвуковую баню на 1 мин. Объем полученного раствора доводят метанолом до метки.

6.1.6.1.5 Массовая концентрация каждого антибиотика в растворах по 6.1.6.1.1 — 6.1.6.1.4 составляет 1 мг/см 3 (или 1000 мг/дм 3 ).

Уточненное значение концентрации антибиотика рассчитывается с учетом содержания основного вещества.

6.1.6.1.6 Раствор антибиотика массовой концентрации 0.1 мг/см 3 (или 100 мг/дм 3 ) готовят из раствора антибиотика массовой концентрации 1 мг/см 3 (6.1.6.1.5) путем его разведения метанолом в 10 раз.

Растворы хранят при температуре минус (20 ± 2) «С не более 3 мес.

Перед применением раствор выдерживают при комнатной температуре в темном месте не менее 20 мин. но не более 2 ч.

6.1.6.2 Приготовление градуировочных образцов

Для построения градуировочного графика готовят серию градуировочных образцов в количестве не менее пяти с массовыми концентрациями антибиотиков в диапазоне от 0.001 мг/дм 3 до 1 мг/дм 3 (для левомицетина в диапазоне от 0,00015 мг/дм 3 до 0,1 мг/дм 3 ) путем разбавления метанолом основных градуировочных растворов антибиотиков, приготовленных по 6.1.6.1.

6.1.6.3 Приготовление раствора внутреннего стандарта демеклоциклина

В мерную пробирку вместимостью 10 см 3 помещают 10 мг демеклоциклина. взвешенного с точностью до 0.5 мг. Добавляют 5 см 3 метанола и помещают в ультразвуковую баню на 1 мин. Объем полученного раствора доводят метанолом до метки.

Массовая концентрация раствора внутреннего стандарта демеклоциклина в растворе составляет 1 мг/см 3 (уточненное значение концентрации внутреннего стандарта рассчитывается с учетом содержания основного вещества).

Путем нескольких разбавлений доводят массовую концентрацию раствора внутреннего стандарта демеклоциклина до значения 1 мкг/см 3 . Раствор с данной концентрацией используют для внесения в исследуемые образцы.

Раствор хранят при температуре минус (20 ± 2) *С не более 3 мес.

Перед применением раствор выдерживают при комнатной температуре в темном месте не менее 20 мин.

6.2 Подготовка хроматографической системы

6.2.1 Включают хроматограф. Подготовку хроматографа к работе осуществляют в соответствии с Руководством по эксплуатации прибора.

6.2.2 Устанавливают следующие условия хроматографирования:

— скорость потока элюента — 0.1 см 3 /мин;

— объем вводимой пробы — 20 мм 3 :

— температура хроматографирования — (30 ± 1) в С;

— длина волны детектирования 280 нм.

Разделение проводят в режиме градиентного элюирования: с 0 % до 55 % мобильной фазы Б (6.1.4.2) за 25 мин.

6.2.3 Перед каждым измерением для оценки работы хроматографа проводят контрольное измерение. вводя в хроматограф образец с известным значением содержания антибиотика. В качестве такого образца может служить раствор антибиотика, приготовленный из реактива антибиотика с известным содержанием антибиотика.

6.3 Построение градуировочной характеристики

6.3.1 Для построения градуировочной зависимости анализируют серию градуировочных образцов. приготовленных по 6.1.6.2. в условиях, описанных в 6.2 и 7.

6.3.2 Используя программное обеспечение, прилагаемое к хроматографу, строят график зависимости массовой концентрации антибиотика от отношения площади хроматографического пика антибиотика к площади пика внутреннего стандарта.

Градуировочная характеристика считается приемлемой, если рассчитанное значение квадрата коэффициента корреляции для градуировочной характеристики каждого антибиотика составит не менее 0.98.

6.3.3 Градуировку проводят не реже одного раза в месяц, а также при изменении условий хроматографического анализа, при смене колонки, при замене реактивов или несоответствии результатов метрологическим требованиям.

6.4 Подготовка проб продуктов

6.4.1 Пробы молока и жидкой молочной продукции перемешивают путем перевертывания емкости с пробами не менее трех раз.

Пробы продуктов освобождают от упаковки, нагревают до температуры (20 ± 2) °С. аккуратно перемешивают и сразу же проводят измерение.

6.4.2 Пробы продуктов, содержащие ароматизаторы, пищевкусовые добавки (кофе, какао, фруктово ягодный или овощной наполнитель и т.д.), образующие с продуктом однородную структуру, а также неотделяемые пищевкусовые компоненты (например, кокосовую стружку), полностью освобождают от упаковки (при наличии), помещают в лабораторный стакан вместимостью 500-1000 см 3 и нагревают на водяной бане до температуры (32 ± 2) *С. после чего полностью переносят в стакан гомогенизатора и гомогенизируют в течение 1-3 мин при частоте вращения ножей от 2000 об/мин до 5000 об/мин до получения однородной массы. Затем пробу переносят в колбу вместимостью 500 см 3 с притертой пробкой и охлаждают до температуры (2012) *С. Пробу для анализа отбирают сразу же после гомогенизации во избежание ее расслоения.

6.4.3 Пробы творога, творожных продуктов и творожных полуфабрикатов нагревают до температуры (20 ± 2) °С. растирают а фарфоровой ступке до получения однородной консистенции и пере* носят в колбу вместимостью 500 см 3 с притертой пробкой.

6.4.4 Пробы сухих молочных продуктов растирают в ступке, тщательно перемешивая.

6.4.5 Пробы мороженого освобождают от глазури и вафель, оставляют при комнатной темпера* туре для отепления. Затем отделяют фрукты, орехи, изюм и другие отделяемые компоненты. При подготовке мороженого с наполнителями, обладающими текучестью (мягкая карамель, сироп, крем-брюле и т.д.), полностью растаявшее мороженое переносят в стакан гомогенизатора вместимостью от 500 см 3 до 1000 см 3 и гомогенизируют в течение 1-3 мин при частоте вращения ножей от 1000 об/мин до 5000 об/мин до получения однородной массы. Затем пробу переносят в колбу вместимостью 500 см 3 с притертой пробкой и охлаждают до температуры (20 ± 2) *С. Пробу для анализа отбирают сразу же после гомогенизации во избежание ее расслоения.

6.4.6 Пробу сыра и сырного продукта измельчают на металлической терке с мелкой перфорацией и аккуратно перемешивают в ступке.

6.4.7 Пробу масла, масляной пасты помещают в стакан вместимостью 100 см 3 , расплавляют на водяной бане при температуре (60 ± 2) *С и перемешивают до получения однородной эмульсии.

6.4.8 Подготовка проб продуктов для хроматографирования

6.4.8.1 В стакан вместимостью 100 см 3 помещают (5.000 ± 0.001) г продукта, подготовленного по

6.4.2 — 6.4.6. Добавляют 20 см 3 раствора элюекта мобильной фазы А (6.1.4.1) и аккуратно перемешивают Полученный раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 см 3 . ополаскивая стакан раствором элюекта мобильной фазы А (6.1.4.1). Объем раствора доводят раствором элюента мобильной фазы А (6.1.4.1) до метки.

Затем колбы с раствором помещают в ультразвуковую баню на 15 мин. охлаждают до температуры (20 ± 2) *С. Полученную смесь фильтруют через бумажный фильтр. В случае получения непрозрачного раствора допускается его центрифугирование при скорости вращения 15000 об/мин в течение 5 мин.

6.4.8.2 В мерную колбу вместимостью 50 см 3 помещают (5,000 ± 0.001) г масла, пасты масляной, подготовленных по 6.4.7. и добавляют 35 см 3 раствора элюента мобильной фазы А (6.1.4.1). Колбу помещают в ультразвуковую баню на 15 мин. охлаждают до температуры (20 1 2) *С. Объем раствора доводят раствором элюента мобильной фазы А (6.1.4.1) до метки. Полученную смесь центрифугируют при скорости вращения 15000 об/мин в течение 5 мин. Для анализа используем водную фракцию.

6.5 Подготовка проб для определения антибиотиков тетрациклиновой группы

В полипропиленовый флакон (виалу) вместимостью 15 см 3 помещают (1.000 ± 0,001) г пробы продукта, подготовленной по 6.4.1, или 10.0 см 3 пробы продукта, подготовленной по 6.4.8, добавляют 0.1 см 3 раствора внутреннего стандарта (6.1.6.3). Затем добавляют 3 см 3 ацетонитрила, закрывают крышкой и интенсивно перемешивают на встряхивателе в течение 3 мин. Оставляют на 15 мин в горизонтальном положении. Далее виалу с образцом помещают в центрифугу, предварительно охлажденную до температуры 4 °С. и центрифугируют при скорости вращения 4000 об/мин в течение 20 мин.

Полученную водную фракцию переносят в мерную пробирку вместимостью 10 см 3 и упаривают до 1 см 3 на нагревательном модуле в токе азота под вакуумом при температуре (40 ± 1) *С. К полученному остатку добавляют 3-5 см 3 буферного раствора (6.1.3). аккуратно перемешивают. Объем раствора доводят буферным раствором (6.1.3) до метки и помещают в ультразвуковую баню на 1 мин.

6.6 Подготовка проб для определения левомицетина, стрептомицина и антибиотиков пенициллиновой группы

В полипропиленовый флакон (виалу) вместимостью 15 см 3 помещают (1.000 ± 0,001) г пробы продукта, подготовленной по 6.4.1. или 10.0 см 3 пробы продукта, подготовленной по 6.4.8. Затем добавляют 3 см 3 ацетонитрила, закрывают крышкой и интенсивно перемешивают на встряхивателе в течение 3 мин. Оставляют на 15 мин в горизонтальном положении. Далее виалу с образцом помещают в центрифугу, предварительно охлажденную до температуры 4 *С. и центрифугируют при скорости вращения 4000 об/мин в течение 20 мин.

6.7 Проведение твердофазной экстракции

Для проведения твердофазной экстракции картридж для ТФЭ предварительно кондиционируют 6 см 3 50 %-ного раствора метанола и уравновешивают 6 см 3 деионизированной воды. Затем вносят пробу продукта, подготовленную по 6.5 или 6.6, и вновь промывают 6 см 3 деионизированной воды. Антибиотики элюируют с сорбента при помощи 6 см 3 раствора элюента мобильной фазы Б (6.1.4.2). Полученный элюат упаривают на нагревательном модуле досуха в токе азота под вакуумом при тем* пературе (40 ± 1) *С, затем растворяют раствором элюента мобильной фазы Б (6.1.4.2) до 0.5 см 3 , после чего используют для хроматографирования.

7 Условия проведения измерений

При выполнении измерений в лаборатории должны соблюдаться следующие условия:

— температура окружающего воздуха. (20 ± 5) в С;

— относительная влажность воздуха . (55 ± 25) %;

-атмосферное давление. (96 ±10) кПа;

— частота переменного тока. (50 ± 5) Гц:

— напряжение в сети . (220 ± 10) В.

8.1 Хроматографирование градуировочных растворов и анализируемой пробы продукта проводят в идентичных условиях.

8.2 Проводят два последовательных измерения. Подготовленную по 6.7 пробу вводят в колонку хроматографа и проводят хроматографический анализ в условиях, указанных в 6.2.2.

Если содержание антибиотиков в анализируемой пробе превышает значение максимального градуировочного уровня, то анализируемую пробу разводят в 10 или более раз мобильной фазой А и проводят повторные измерения.

9 Обработка результатов измерений

9.1 Обработка результатов измерений содержания антибиотиков тетрацикликовой группы, полученных с применением внутреннего стандарта

Определение содержания антибиотиков тетрациклиновой группы выполняют с помощью программного обеспечения, прилагаемого к хроматографу. С помощью программы обработки спектров вычисляют отношение площади пика определяемого антибиотика к площади пика внутреннего стандарта. Затем, используя программу обработки данных, рассчитывают содержание соответствующего антибиотика в подготовленной пробе.

9.2 Обработка результатов измерений содержания антибиотиков пенициллиновой группы, левомицетина (хлорамфеникола) и стрептомицина

Определение содержания антибиотиков выполняют с помощью программного обеспечения, прилагаемого к хроматографу. Используя градуировочный график, рассчитывают значение массовой концентрации соответствующего антибиотика в подготовленной пробе.

9.3 Массу пробы продукта, взятую для разведения, т, г. вычисляют по формуле

где т, — масса пробы продукта, подготовленная по 6.4.2 — 6.4.7, взятая для анализа и отобранная по 6.4.9. П

Иг — объем пробы, подготовленный по 6.4.8 и взятый для анализа (6.5 — 6.6). см 3 .

V, — общий объем растаора. полученный при разведении пробы продукта согласно 6.4.8. см 3 , (У, =50 см 3 ).

9.4 Массовую долю антибиотика в продукте X. млн 1 (мг/кг). вычисляют по формуле

где С — массовая концентрация антибиотика, найденная по градуировочному графику, мг/дм 3 :

Уз — объем элюата после выпаривания по 6.7. см 3 ;

т — масса пробы продукта, подготовленная по 6.4.1 и отобранная для анализа (6.S-6.6) или определенная по формуле (1). г.

За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение результатов двух по* следовательных измерений, выполненных в условиях повторяемости (ГОСТ ИСО 5725-1. пункт 3.14), если соблюдается условие приемлемости по 10.1.

9.5 Контроль точности результатов измерений

Приписанные характеристики погрешности и ее составляющих метода определения содержания антибиотиков в молоке и продуктах переработки молока при Р = 0.95 приведены в таблице 1.

Диапазон измерений массовой доли антибиотиков, млн 1 (мг/кг)

источник