Меню Рубрики

Определение левомицетина методом вэжх

СТАЙЛАБ предлагает тест-системы для определения левомицетина (хлорамфеникола) в молоке в соответствии с ГОСТ Р 52842-2007 (ИСО 18330:2003), сухом молоке, масле, сыре, твороге, молочных продуках (кефире, сметане, йогурте, йогурте с фруктами), меде, пчелином маточном молочке, креветках, рыбной муке, мясе, яйцах по МУК 4.1.3535-18, сыворотке крови/плазме, моче, комбикормах, ферментах, вине и виноградном соке.

Иммунохроматографический метод анализа, тест-полоски
9268 Сухое молоко с содержанием хлорамфеникола 0,13 мкг/кг, 17 мл
9267 Сухое молоко с содержанием хлорамфеникола 0,34 мкг/кг, 17 мл
9269 Сухое молоко с содержанием хлорамфеникола менее 0,015 мкг/кг, 17 мл, для отрицательного контроля
S-4032 cтандарт хлорамфеникола SPEX
Чистые вещества и стандарты сульфаниламидов, нитроимидазолов, пенициллинов, амфениколов для анализа в соответствии с ГОСТ 54904-2012

Левомицетин (хлорамфеникол, хлоромицетин) – это антибиотик широкого спектра действия. Он обладает бактериостатическим действием и эффективен против возбудителей таких заболеваний, как дизентерия, брюшной тиф, пневмония, газовая гангрена, сибирская язва бактерий рода Yersinia (возбудители иерсиниоза, псевдотуберкулеза и чумы) и многих других опасных микроорганизмов. Хлорамфеникол очень хорошо растворяется в жирах и в значительных количествах выделяется с молоком. Его молекула имеет небольшие размеры, и это, вместе с жирорастворимостью, позволяет ему легко проникать во все ткани тела, в том числе, в мозг.

ВОЗ рекомендует использовать масляную суспензию хлорамфеникола в качестве первой линии терапии менингита в странах с низким уровнем дохода. В форме мазей для наружного использования он применяется при фурункулезе и других кожных заболеваниях, а также при ранениях. Многие лечат с помощью левомицетина пищевые токсикоинфекции («пищевые отравления»). Согласно источникам, хлорамфеникол проявляет активность в отношении некоторых крупных вирусов. При этом микроорганизмы очень медленно вырабатывают резистентность к нему, потому левомицетин остается очень эффективным антибиотиком.

В сельском хозяйстве и ветеринарии левомицетин применяется для лечения животных и птицы, больных желудочно-кишечными заболеваниями, в том числе, кокцидиозом, который вызывают паразиты. Также его используют для лечения заболеваний дыхательных путей.

Впервые хлорамфеникол выделили в 1947 году из культуры почвенного микроорганизма Streptomyces venezuelae. В клинической практике он используется с 1949 года. Позднее левомицетин научились синтезировать искусственным путем, и в настоящее время его получают именно таким способом.

В России хлорамфеникол входит в список жизненно необходимых и важнейших лекарственных препаратов и применяется в животноводстве и ветеринарии. В США левомицетин не выпускается для перорального употребления с 1991 года. В странах Евросоюза использование этого средства в животноводстве запрещено. Рекомендации применять хлорамфеникол только для лечения тяжелых заболеваний, запреты на его использование в животноводстве или необходимость контролировать содержание левомицетина в пищевых продуктах связаны с побочными эффектами этого средства, возникающими при хроническом воздействии на человека. Одним из таких эффектов являются реакции гиперчувствительности вплоть до анафилактического шока. Но чаще они выражаются в крапивнице и других кожных проявлениях, особенно при использовании мазей с левомицетином.

Левомицетин метаболизируется в печени с образованием глюкоронида хлорамфеникола – неактивного соединения. В этом виде он выводится почками. Хлорамфеникол ингибирует активность одного из ферментов печени, участвующего в обмене стероидов и некоторых других соединений, а также в нейтрализации токсичных веществ, что нарушает работу печени. В некоторых случаях левомицетин вызывать почечные кровотечения. Хлорамфеникол долгое время остается в организме животных и в пищевых продуктах, в том числе, в мясе и молоке.

Длительное употребление левомицетина в высоких дозировках может вызывать желудочно-кишечные расстройства, раздражение слизистых оболочек рта и желудочно-кишечного тракта, а также возникновение язв на них. Кроме того, он подавляет микрофлору кишечника, что часто приводит к расстройствам пищеварения или вторичной грибковой инфекции.

Самые опасные эффекты хронического употребления левомицетина связаны с его воздействием на кроветворную систему. Он вызывает апластическую анемию (атрофию кроветворения): неизлечимое заболевание, вызванное повреждением клеток костного мозга. При ней снижается количество всех трех типов клеток крови: лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов. Это редкое осложнение, и при употреблении левомицетина оно чаще всего возникает, если это средство применяли перорально. К другим осложнениям со стороны кроветворной системы относится подавление работы костного мозга, а также лейкемия («рак крови»). Чаще всего такая реакция возникает у детей, причем риск ее возникновения увеличивается с увеличением длительности употребления левомицетина.

Дозы левомицетина, способные вызывать побочные эффекты, в том числе, апластическую анемию, до сих пор не определены. Поэтому в странах Евросоюза использование левомицетина при производстве пищевых продуктов животного происхождения запрещено. Минимальный предел чувствительности методов анализа, с помощью которых в Евросоюзе допускается проводить определение левомицетина (хлорамфеникола) в пище составляет 0,3 мкг/кг.

Согласно гигиеническим требованиям к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, принятым в Российской Федерации и странах Таможенного Союза, в соответствии с Техническим Регламентом Таможенного Союза ТР ТС 021/2011 («О безопасности пищевой продукции») содержание левомицетина (хлорамфеникола) в яйцах, мясе и других продуктов не допускается (должно быть менее 0,01 мг/кг, или 10 мкг/кг). Такие же нормы установлены для молочных продуктов Техническим Регламентом Таможенного Союза ТР ТС 033/2013 «О безопасности молока и молочной продукции». С 1 июля 2015 года, согласно ТР ТС 033/2013, максимально допустимое содержание левомицетина в молоке не должно превышать 0,0003 мг/кг (0,3 мкг/кг), что соответствует также нормам Евросоюза. С актуальными законодательными нормативами можно ознакомиться на сайте compact24.com.

Остаточные количества левомицетина (хлорамфеникола) в пищевых продуктах можно определять методами радиоиммуного анализа и жидкостной хроматографии высокого давления. Однако данные методы реализуются на дорогостоящем оборудовании и занимают длительное время. Кроме того, радиоиммунный метод анализа предполагает использование радиоактивных материалов, а хроматографические методы требуют квалифицированного обслуживания и трудоемки. Микробиологические методы определения антибиотиков, в том числе, левомицетина, просты и дешевы, но недостаточно специфичны, поскольку многие микроорганизмы чувствительны к различным антибиотикам.

Для скрининга и в рутинной лабораторной практике широко применяют иммуноферментный метод анализа. Например, с сентября 1998 г. в Германии ИФА является официальным методом скрининга остатков левомицетина в молоке; см.§ 35 LMBG, 01.00 68. В Белоруссии утверждены МУК 10-1-5/118/В от 18.08.2003 по контролю левомицетина в молоке, сухом молоке, яйцах и мясе с помощью тест-системы RIDASCREEN® Chloramphenicol. В России метод иммуноферментного анализа для определения левомицетина в пищевых продуктах утвержден МУК 4.1.1912-04.

источник

«Определение остаточных количеств левомицетина (хлорамфеникола, хлормицетина) в продуктах животного происхождения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и иммуноферментного анализа. Методические указания. МУК 4.1.1912-04»

Документ по состоянию на август 2014 г.

Утверждаю
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации,
Первый заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
6 марта 2004 года

Дата введения —
1 мая 2004 года

1. Разработаны: ГУ НИИ питания РАМН (В.А. Тутельян, С.А. Хотимченко, С.А. Шевелева, В.К. Кирничная, Т.В. Киселева, Н.Г. Орлова, Н.Р. Ефимочкина, Н.В. Барбер), Московским государственным университетом им. М.В. Ломоносова (А.М. Егоров, А.Ю. Колосова, Ж.В. Самсонова).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Минздрава России.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г. Онищенко 6 марта 2004 г.

4. Введены в действие 1 мая 2004 г.

Настоящие Методические указания предназначены для учреждений госсанэпидслужбы Минздрава РФ и других ведомств, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов в соответствии с СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов».

Методические указания распространяются на методы с различным целевым назначением (арбитраж, скрининг). Два метода определения остаточных количеств левомицетина (хлорамфеникола, хлормицетина) в продуктах животного происхождения:

I — высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ);

II — иммуноферментного анализа (ИФА).

Среди ряда веществ, которые могут контаминировать продовольственное сырье и пищевые продукты, важное место занимают ветеринарные препараты, используемые как для лечения животных, так и в качестве стимуляторов роста. Сильнодействующими лекарственными препаратами, используемыми в ветеринарии, остаются антибиотики. Известно большое число антибиотиков, обладающих различными свойствами, механизмом и спектром действия, распределением в организме животных, характером метаболизма и т.д.

Систематическое поступление в организм человека антибиотиков с продуктами питания крайне вредно, поскольку они могут оказывать нежелательные эффекты, чаще всего в виде возникновения аллергических реакций, дисбактериозов, подавлять активность некоторых ферментов, изменять микрофлору кишечника, способствовать распространению устойчивых форм микроорганизмов и т.д. Следует учитывать возможность отрицательного влияния антибиотиков в сырье для пищевой промышленности на проведение ряда технологических процессов в переработке мяса, рыбы, молока (в частности, при получении кисломолочных продуктов) и других продуктов. Кроме того, наличие антибиотиков может затруднять бактериологические исследования качества продуктов животного происхождения.

Хлорамфеникол (далее — ХАФ) является антибиотиком широкого спектра действия, обладающим высокой активностью в отношении бактерий и риккетсий. В отличие от многих антибиотиков ХАФ обладает довольно простым химическим строением.

Хлорамфеникол малорастворим в воде, но хорошо в спирте. Установлено, что ХАФ медленно выводится из организма животных и сравнительно долго сохраняет свою активность при хранении продуктов.

В настоящее время для определения ХАФ в продуктах питания применяют ряд методов, в их числе микробиологические методы, которые являются сравнительно простыми и дешевыми, однако отличаются недостаточной специфичностью и воспроизводимостью результатов.

Для арбитражных исследований вводятся хроматографические методы, в частности ВЭЖХ, позволяющий раздельно определять как ХАФ, так и его метаболиты.

Количественный метод определения ХАФ при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии в сельскохозяйственных продуктах отличается низким пределом обнаружения (0,01 мг/кг), хорошей воспроизводимостью (относительное стандартное отклонение 0,15 — 0,21) и надежностью.

Для скрининговых целей в мире широко применяют методы иммунохимического анализа, обеспечивающие высокую чувствительность, специфичность и точность. Для контроля пищевой продукции предпочтение отдается методам твердофазного иммуноферментного анализа, которые являются высокочувствительными (предел обнаружения — 0,00008 мг/кг).

Методические указания предназначены для учреждений госсанэпидслужбы Минздрава РФ и других ведомств, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов. Согласно СанПиН 2.3.2.1078-01 содержание левомицетина в продуктах животного происхождения не допускается.

Отбор и подготовка проб аналогичны для обоих методов исследования.

Отбор продуктов питания осуществляется в соответствии с требованиями ГОСТов на исследуемые продукты: ГОСТ 7269-79 «Мясо», ГОСТ 7202.0-74 «Мясо птицы», ГОСТ 3622-68 «Молоко и молочные продукты».

Отобранные образцы продуктов герметично упаковывают в полиэтиленовые мешки, стеклянные банки с притертыми крышками или укладывают в коробки. Образцы доставляют в лабораторию для анализа сразу же после отбора проб или, в случае необходимости, хранят на холоде, а для скоропортящихся продуктов осуществляют замораживание -4 — -10 °С, используя для этой цели холодильники или соответствующие приспособления.

К исследованию скоропортящихся образцов следует приступать в день их доставки в лабораторию. При отсутствии такой возможности образцы должны хранить при указанной выше температуре не более двух недель со времени отбора среднего образца.

4. Определение остаточных количеств левомицетина (хлорамфеникола, хлормицетина) в продуктах животного происхождения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Метод основан на извлечении хлорамфеникола экстракцией этилацетатом, последовательной промывке экстракта разбавленным раствором щелочи и кислоты, обезжиривании петролейным эфиром и хроматографическом разделении с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии в обращенно-фазном варианте.

Помещение, в котором проводится определение хлорамфеникола, должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Все операции анализа необходимо проводить в вытяжном шкафу с использованием индивидуальных средств защиты.

4.4.1. Приготовление растворов

Взвешивают 25 мг левомицетина, помещают в мерную колбу на 25 куб. см и растворяют в метаноле, концентрация левомицетина 1 мг/мл. В мерную колбу на 25 куб. см помещают 0,25 куб. см полученного раствора и разбавляют метанолом до метки. Концентрация левомицетина в стандартном растворе 10 нг/мкл.

Для подтверждения наличия левомицетина к 50 мкл метанольного экстракта приливают 50 мкл 10%-ного раствора КОН и нагревают 20 мин. при 70 °С, 10 мкл полученного раствора вводят в тех же условиях в колонку жидкостного хроматографа. На полученной хроматограмме пик с временем удерживания левомицетина отсутствует. Это подтверждает наличие левомицетина в образце.

4.8.1. За окончательный результат измерения принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. Окончательный результат округляют до второго десятичного знака.

МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХЛОРАМФЕНИКОЛА В ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ (МОЛОКЕ, МЯСЕ, ЯЙЦАХ)

4.8.2. Если расхождение результатов двух параллельных определений (сходимость и воспроизводимость) превышает требования по п. 4.8.1, то повторно проводят два новых параллельных определения.

5. Определение хлорамфеникола (левомицетина) в продуктах животного происхождения (молоке, мясе, яйцах) методом иммуноферментного анализа

В основу метода количественного определения ХАФ в продуктах питания положен принцип твердофазного конкурентного ИФА на полистироловых планшетах. Принцип метода основан на конкуренции свободного ХАФ из измеряемой пробы и ХАФ, предварительно иммобилизованного на твердой фазе в составе белкового конъюгата, за центры связывания специфичных к ХАФ антител. После отделения несвязавшихся реагентов количество антител, прореагировавших с иммобилизованным антигеном, определяют с помощью антивидовых антител, меченных пероксидазой хрена. Количество связавшегося с антителами конъюгата вторичных антител выявляют с помощью субстрат-хромогенной смеси. Количество определяемого антибиотика, содержащегося в исследуемом образце, обратно пропорционально регистрируемой оптической плотности продукта ферментативной реакции.

Пределы обнаружения метода — 0,000012 — 0,00008 мг/кг.

5.3.2. Состав набора «Ридаскрин Левомицетин»

Микротитровальный планшет на 96 лунок (12 стрипов по 8 лунок), сенсибилизированных антителами «захвата» — 1 шт.

Комплект стандартных растворов левомицетина со следующими концентрациями: 0; 0,5; 1,5; 4,5; 13,5; 40,5 нг/куб. см в буферном растворе по 1,3 мл — 6 шт.

Конъюгат левомицетина с пероксидазой — 0,7 куб. см.

Антитела к левомицетину — 0,7 куб. см.

Субстрат, содержит пероксид карбамида — 7 куб. см.

Хромоген, содержит тетраметилбензидин — 7 куб. см.

Стоп-реагент, содержит 1 N серную кислоту — 14 куб. см.

Буфер 1, для разбавления стандартных растворов левомицетина, конъюгата, антител, растворов образцов и буфера 2 — 100 куб. см.

Буфер 2, для разбавления стандартных образцов при анализе молока — 1 куб. см.

Наборы рассчитаны на проведение анализа в 2-х повторностях 41 исследуемого образца и 6 калибровочных проб (всего 96 определений на один планшет).

5.3.3. Аналитические характеристики наборов

Специфичность. Использование высоко аффинных антител к ХАФ обеспечивает высокую специфичность анализа. Процент перекрестной реакции с сукцинатом ХАФ составляет 25%, с дезацилированным ХАФ, являющимся одним из метаболитов антибиотика, — менее 1%, с антибиотиками других групп — менее 1%.

Чувствительность. Минимальная концентрация ХАФ, определяемая с помощью набора, составляет 0,00008 мг/кг (куб. дм).

Воспроизводимость. Коэффициент вариации результатов определений концентраций ХАФ с помощью набора не превышает 12%.

Тест на открытие. Процент открытия составляет 70 — 130%.

Линейность. Линейность составляет 90 — 110%.

Диапазон определяемых концентраций 0,0001 — 0,1 мг/кг (куб. дм).

Проверка набора. При параллельном определении концентрации хлорамфеникола в продуктах питания животного происхождения с помощью набора ИФА-ХАФ и метода ВЭЖХ коэффициент корреляции составляет 0,975.

5.3.3.2. Набор «Ридаскрин Левомицетин»

Чувствительность (пределы обнаружения) — 0,000012 — 0,00005 мг/кг (куб. дм).

Перекрестная чувствительность: левомицетин — 100%, левомицетин основной — 0,5%, тиамфеникол — менее 0,05%. Нет чувствительности к тетрациклинам, гентамицину, ампициллину и флорфениколу.

Все компоненты наборов, за исключением о-фенилендиамина, в используемых концентрациях не токсичны. О-фенилендиамин обладает канцерогенным действием. Поэтому в случае попадания вещества на кожные или слизистые покровы следует немедленно тщательно смыть его большим количеством воды. Стоп-реагент содержит в своем составе серную кислоту. Следует избегать контакта стоп-реагента с кожей.

Все разведения реагентов и расчеты представлены для проведения анализа на 1 планшете.

Построение калибровочной кривой необходимо проводить для каждого планшета.

5.5.1. Приготовление реагентов

5.5.1.1. Приготовление фосфатно-солевого буфера, содержащего детергент (ФСБТ)

Содержимое двух флаконов с фосфатно-солевым буферным раствором количественно перенести в стакан и довести общий объем раствора до 400 куб. см дистиллированной водой. Полученный буфер может храниться закрытым в течение 5 дней при температуре не выше 2 — 8 °С.

5.5.1.2. Приготовление буфера 1

Содержимое флакона с концентратом буфера количественно перенести в стакан и довести общий объем раствора до 50 куб. см ФСБТ. Полученный буфер может храниться в течение 5 дней при температуре 2 — 8 °С.

5.5.1.3. Приготовление образцов для анализа

Молоко. Пробу молока развести перед анализом в 100 раз буфером 1.

Мясо. Встряхивают 3 г измельченной ткани (фарша) с 6 куб. см этилацетата в течение 5 мин., затем центрифугируют в течение 10 мин. Упаривают досуха 1 куб. см верхней фазы. Осадок перемешивают с 3 куб. см ФСБТ и центрифугируют при 3000 g в течение 5 мин. Супернатант отбирают и разводят в 50 раз ФСБТ.

Яйца. Взвешивают по 3 г смешанного (гомогенизированного) содержимого яйца в реакционную посуду и проводят дальнейшую пробоподготовку, как описано для образцов мяса.

5.5.1.4. Приготовление калибровочных проб (КП)

Калибровочные пробы готовятся заново при каждом определении.

Молоко. Калибровочные пробы готовятся из стандартного раствора ХАФ в метаноле (1 мг/куб. см) по следующей схеме.

1. Приготовить 5 куб. см раствора ХАФ в ФСБТ с концентрацией 0,01 мг/куб. см (5 куб. см раствора содержат 0,05 куб. см стандартного раствора ХАФ в метаноле).

2. Приготовить 1 куб. см калибровочной пробы 6 (КП 6) в буфере 1 с концентрацией 100 нг/куб. см (1 куб. см раствора содержит 0,01 куб. см раствора, приготовленного на стадии 1).

3. Последующие калибровочные пробы готовят по схеме из КП 6 с использованием буфера 1:

Мясо (яйца). Калибровочные пробы готовятся из стандартного раствора ХАФ в метаноле (1 мг/куб. см) по вышеприведенной схеме. На всех стадиях используется буфер ФСБТ.

5.5.1.5. Приготовление рабочего раствора антител

Рабочий раствор антител готовится непосредственно перед использованием.

Содержимое одного флакона с лиофилизированными антителами растворить в 6 куб. см ФСБТ. Полученный раствор хранению не подлежит.

5.5.1.6. Приготовление рабочего раствора конъюгата

Рабочий раствор конъюгата готовится непосредственно перед использованием.

Содержимое одного флакона с конъюгатом количественно перенести в стакан и довести общий объем до 15 куб. см ФСБТ — при анализе образцов молока и до 30 куб. см — при анализе образцов мяса и яиц. Полученный раствор хранению не подлежит.

5.5.1.7. Приготовление субстратно-хромогенной смеси

Субстратно-хромогенную смесь готовят непосредственно перед использованием.

Для приготовления раствора применять только химически чистую посуду.

В 11,25 куб. см дистиллированной воды растворить 1 таблетку о-фенилендиамина, тщательно перемешивая и избегая попаданий света. К полученному раствору количественно добавить 1,25 куб. см концентрата субстратного буферного раствора. Субстратно-хромогенная смесь, подготовленная к работе, хранению не подлежит.

Внесение реагентов следует проводить согласно схеме:

5.5.2.1. В два ряда лунок планшета внести калибровочные пробы (КП), приготовленные по п. 5.5.1.4, по 0,05 куб. см, начиная с минимальной концентрации. Рекомендуется не вносить калибровочные пробы в крайние ряды планшета во избежание влияния краевого эффекта. При разнице более 0,1 единицы оптической плотности в результатах параллельных проб на крайних рядах учитывать результат крайнего ряда не следует.

В оставшиеся лунки внести в дубликатах исследуемые образцы в объеме 0,05 куб. см.

Процедуру внесения образцов следует выполнять как можно быстрее. Вся операция не должна превышать 12 — 15 мин.

5.5.2.2. Во все лунки планшета внести по 0,05 куб. см рабочего раствора антител, приготовленного по п. 5.5.1.5. Антитела вносить в лунки планшета в той же последовательности, что и калибровочные пробы и исследуемые образцы.

5.5.2.3. Плотно закрыть планшет крышкой и выдержать при температуре 37 °С в течение 1,5 ч в термостате.

5.5.2.4. Содержимое лунок удалить стряхиванием. Затем провести отмывку. Для этого в каждую лунку планшета внести по 0,35 куб. см промывочного буферного раствора, оставить на 1 — 2 мин., а затем удалить содержимое лунок стряхиванием. Процедуру повторить 4 раза. После этого тщательно удалить остатки влаги из лунок, несколько раз вытряхнув планшет о марлевую салфетку или фильтровальную бумагу.

5.5.2.5. Во все лунки планшета внести по 0,1 куб. см рабочего раствора конъюгата, приготовленного по п. 5.5.1.6.

5.5.2.6. Плотно закрыть планшет крышкой и выдержать при температуре 37 °С в течение 1 ч в термостате.

5.5.2.7. Содержимое лунок удалить стряхиванием. Затем провести отмывку. Для этого в каждую лунку планшета внести по 0,35 куб. см промывочного буферного раствора, оставить на 1 — 2 мин., а затем удалить содержимое лунок стряхиванием. Процедуру повторить 5 раз. После этого тщательно удалить остатки влаги из лунок, несколько раз вытряхнув планшет о марлевую салфетку или фильтровальную бумагу.

5.5.2.8. Во все лунки планшета внести по 0,1 куб. см раствора субстратно-хромогенной смеси и выдержать планшет при комнатной температуре 18 — 25 °С в темном месте в течение 30 — 35 мин. при анализе образцов молока и 7 — 10 мин. — при анализе образцов мяса или яиц.

5.5.2.9. Внести во все лунки планшета по 0,35 куб. см стоп-реагента (раствора серной кислоты).

5.5.2.10. Измерить оптическую плотность в лунках планшета при длине волны 490 нм. Окраска планшета стабильна в течение 1 ч в темноте.

Построить калибровочную кривую зависимости оптической плотности от концентрации ХАФ в калибровочных пробах (следует использовать логарифмический масштаб для оси абсцисс). Соединить кривой (по лекалу) полученные точки. Образец калибровочной кривой приведен ниже (не приводится).

Рассчитать средние арифметические значения показателей оптической плотности испытуемых образцов и по калибровочной кривой определить в них концентрацию ХАФ, учитывая фактор разбавления, который равен 100, для всех образцов.

5.5.4. Условия хранения и эксплуатации набора

Набор реагентов ИФА-ХАФ должен храниться при температуре 2 — 8 °С в течение всего срока годности. Допускается хранение набора при температуре до 25 °С не более 5 суток. Срок годности набора — 12 мес. Компоненты набора перед использованием необходимо выдержать при комнатной температуре 18 — 25 °С не менее 30 мин. Раствор антител, конъюгата и субстратно-хромогенная смесь хранению не подлежат. Промывочный буферный раствор может храниться после разведения при температуре 2 — 8 °С в течение 5 дней. При вскрытии и растворении лиофилизированных компонентов набора необходимо следить, чтобы на пробках не осталось сухого вещества.

Образцы, предназначенные для анализа, должны храниться в холодильнике, в темном месте.

Пробу молока объемом 5 куб. см охладить до 8 °С, перенести в стеклянную центрифужную пробирку, центрифугировать при 4 — 12 °С в течение 15 мин. при 3000 g. Удалить верхний слой жира и перенести аликвоту обезжиренного молока в новую чистую пробирку. Для анализа использовать 0,05 куб. см раствора на 1 лунку планшета. Фактор разбавления — 1. Предел обнаружения — 0,00005 мг/кг. Предел количественного обнаружения — 0,00015 мг/кг.

Примечание: для приготовления стандартных растворов для измерения проб молока использовать буфер 2.

5.6.1.2. Исследования сухого молока

Взвесить в центрифужной стеклянной пробирке 2 г сухого молока, добавить 10 куб. см дистиллированной воды и встряхивать пробирку до растворения пробы. Добавить в пробирку по 1 куб. см осадителя 1 и осадителя 2. Пробы тщательно перемешать на вортексе и центрифугировать при 4 — 12 °С в течение 10 мин. при 3000 g. Перед центрифугированием пробы охладить до 8 °С, перенести 3,6 куб. см супернатанта (что соответствует 0,6 г сухого молока) в чистую пробирку. Добавить в пробирку 6 куб. см этилацетата и экстрагировать встряхиванием в течение 10 мин. Центрифугировать при комнатной температуре (20 — 25 °С) в течение 10 мин. при 3000 g.

Перенести 4 куб. см эфирного экстракта (соответствует 0,4 г сухого молока) в новую чистую пробирку и испарить экстракт досуха при 60 °С в слабом токе азота. Растворить сухой остаток в 0,4 куб. см буфера 1 и тщательно перемешать на вортексе. Для анализа используют 0,05 куб. см раствора на 1 лунку планшета.

Гомогенизировать пробу массой не менее 100 г в гомогенизаторе. Взвесить в стеклянной центрифужной пробирке 3 г гомогената, смешать с 3 куб. см дистиллированной воды и добавить 6 куб. см этилацетата. Интенсивно встряхивать пробирку по оси «вверх-вниз» в течение 10 мин. Центрифугировать при комнатной температуре (20 — 25 °С) в течение 10 мин. при 3000 g.

Перенести 4 куб. см эфирного экстракта (соответствует 2 г пробы) в новую чистую пробирку и испарить экстракт досуха на микроиспарителе при 60 °С в слабом токе азота. Растворить сухой остаток в 1 куб. см смеси изооктана с хлороформом в соотношении 2:3 и тщательно перемешать на вортексе. Добавить к раствору 0,5 куб. см буфера 1 и интенсивно перемешивать на вортексе в течение 1 мин. Центрифугировать при комнатной температуре (20 — 25 °С) в течение 10 мин. при 3000 g или более высоком ускорении.

Для анализа использовать 0,05 куб. см раствора (водный верхний слой ) на 1 лунку планшета.

В случае образования пены или геля в межфазовой зоне при недостаточном объеме водной фазы поместить пробирку на 5 мин. в водяную баню при температуре 80 °С и затем еще раз центрифугировать.

Гомогенизировать пробу массой не менее 100 г смешанного содержимого яйца в гомогенизаторе. Взвесить в стеклянной центрифужной пробирке 2 г гомогената, смешать с 12 куб. см этилацетата. Интенсивно встряхивать пробирку по оси «вверх-вниз» в течение 10 мин. Центрифугировать при комнатной температуре (20 — 25 °С) в течение 10 мин. при 3000 g.

Перенести 6 куб. см эфирного экстракта (соответствует 1 г пробы) в новую чистую пробирку и испарить экстракт досуха при 60 °С в слабом токе азота. Растворить сухой остаток в 1 куб. см смеси изооктана с хлороформом в соотношении 2:3 и тщательно перемешать на вортексе.

Добавить к раствору 1 куб. см буфера 1 и интенсивно перемешивать на вортексе в течение одной минуты. Центрифугировать при комнатной температуре (20 — 25 °С) в течение 10 мин. при 3000 g или более высоком ускорении.

Для анализа использовать 0,05 куб. см раствора (водный верхний слой ) на лунку планшета.

В случае образования пены или геля в межфазной зоне при недостаточном объеме водной фазы поместить пробирку на 5 мин. в водяную баню при температуре 80 °С и затем еще раз отцентрифугировать.

5.6.2.1. Предварительная подготовка

Перед использованием набора довести температуру всех реагентов до комнатной температуры (20 — 25 °С). Немедленно после использования охладить все оставшиеся реагенты до температуры 2 — 8 °С.

В процессе выполнения анализа не допускать высыхания лунок планшета.

На всех стадиях инкубации избегать воздействия прямого солнечного света. При инкубации планшета закрыть его непрозрачным экраном.

5.6.2.2. Приготовление раствора конъюгата

Перед разбавлением концентрированного раствора конъюгата осторожно встряхнуть содержимое флакона. Для приготовления рабочего раствора конъюгата разбавить концентрат конъюгата буферным раствором 1, имеющимся в комплекте набора, в отношении 1:11 (например, смешать 0,2 куб. см концентрата конъюгата с 2 мл буфера — данного разведения достаточно для 4-х стрипов по 8 лунок).

5.6.2.3. Приготовление раствора антител

Перед разбавлением концентрата антител осторожно встряхнуть содержимое флакона. Для приготовления рабочего раствора антител разбавить концентрат буферным раствором 1, имеющимся в комплекте набора, в отношении 1:11 (например, смешать 0,2 куб. см концентрата антител с 2 куб. см буфера 1 — данного разведения достаточно для 4-х стрипов).

5.6.2.4. Приготовление буферного раствора 2 (только для проб молока)

Для приготовления готового буферного раствора 2, использующегося при исследовании проб молока, разбавить концентрат буфера 2 в 9 куб. см буферного раствора 1 и энергично перемешать с помощью встряхивателя типа «вортекс», периодически подогревая раствор до 40 °С. Мутность раствора не влияет на результат определения, однако осадок на дне флакона после перемешивания должен равномерно распределяться в объеме раствора.

5.6.2.5. Подготовка микротитровального планшета

Перед выполнением анализа из планшета следует извлечь необходимое количество стрипов.

Остальные стрипы следует тщательно упаковать в фольгированный пакет вместе с осушителем, закрыть застежку пакета и поместить на хранение при температуре 2 — 8 °С.

5.6.2.6. Приготовление стандартных растворов

Для приготовления рабочих стандартных растворов левомицетина концентрированные растворы, входящие в состав набора, следует разбавить буфером 1 (или буфером 2) в указанной пропорции. Для разбавления использовать только стеклянную посуду.

После разбавления тщательно перемешивать готовые растворы.

Для каждой серии исследований следует готовить свежие стандартные растворы.

При исследовании образцов молока для разведения стандартов использовать буферный раствор 2.

Вставить в рамку планшета стрипы (лунки) в количестве, необходимом для выполнения всех запланированных определений в двух повторностях. Записать координаты лунок, предназначенных для стандартных растворов и подготовленных исследуемых растворов. Пример формы записи приведен на рис. 1.

5.6.3.1. Добавить по 0,05 куб. см стандартных растворов и растворов исследуемых образцов в соответствующие пары лунок.

5.6.3.2. Добавить по 0,05 куб. см разбавленного раствора конъюгата в каждую лунку.

5.6.3.3. Добавить в каждую лунку по 0,05 куб. см готового разбавленного раствора антител. Перемешать вручную, избегая попадания смеси в соседние лунки, и оставить на инкубацию в течение 2 ч при комнатной температуре (20 — 25 °С).

5.6.3.4. Вылить жидкость из лунок, перевернуть рамку планшета и выбить капли жидкости, оставшиеся в лунках, путем энергичного троекратного постукивания рамки с лунками по столу, накрытому фильтровальной бумагой. Наполнить лунки 0,25 куб. см дистиллированной воды и снова вылить воду. Выбить капли воды, как описано выше. Повторить процедуру промывки лунок водой еще два раза.

5.6.3.5. Добавить по 0,05 куб. см раствора субстрата и по 0,05 куб. см раствора хромогена в каждую лунку. Перемешать вручную, соблюдая осторожность, и инкубировать при комнатной температуре (20 — 25 °С) в течение 30 мин. в темноте.

5.6.3.6. Добавить в каждую лунку по 0,1 куб. см раствора стоп-реагента и хорошо перемешать вручную. В течение 60 мин. после добавления стоп-реагента измерить оптическую плотность в каждой лунке при 450 нм (нулевое считывание по воздуху).

5.6.4. Определение количества левомицетина в исследованных пробах

Средние значения оптической плотности, измеренной в лунках со стандартными и исследуемыми растворами, делятся на среднее значение оптической плотности, измеренной в лунках с первым (нулевым) стандартом, результат умножается на 100. Таким образом, результат измерения оптической плотности выражается в процентах от оптической плотности лунки с нулевым стандартом, то есть:

По величинам относительного поглощения, вычисленным для стандартных растворов, и соответствующим значениям концентрации левомицетина в нг/кг строится калибровочная кривая в полулогарифмической системе координат. Калибровочная кривая должна быть почти линейна в диапазоне 50 — 1350 нг/кг (см. рис. 2).

Концентрация левомицетина в растворах исследуемых образцов в нг/кг (или нг/куб. дм) определяется по калибровочной кривой соответственно относительному поглощению, измеренному и вычисленному для этих растворов.

Для того чтобы вычислить концентрацию левомицетина в исследуемой исходной пробе, величину концентрации левомицетина, полученную по калибровочной кривой, следует умножить на соответствующий фактор разбавления (см. п. 5.5.1.1 — 5.5.1.4). Результат исследования выражают в мг/кг или мг/куб. дм.

При выполнении пробоподготовки по п. п. 5.5.1.3 и 5.5.1.4 холостые пробы могут показывать положительный результат на уровне 2-й стандартной пробы. При расчете концентрации левомицетина в исследуемых пробах рекомендуется учитывать фоновый сигнал с помощью постановки холостого опыта. Для этого в каждой серии анализов необходимо выполнять испарение 4 куб. см чистого этилацетата и далее следовать процедуре, описанной в п. 5.5.3. Измеренный фоновый сигнал далее следует вычитать на стадии обработки результатов.

5.7.1. За окончательный результат измерения принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. Окончательный результат округляют до второго десятичного знака.

МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХЛОРАМФЕНИКОЛА В ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ (МОЛОКЕ, МЯСЕ, ЯЙЦАХ)

5.7.2. Если расхождение результатов двух параллельных определений (сходимость и воспроизводимость) превышает требования по п. 5.6.1, то повторно проводят два новых параллельных определения.

источник

Способ определения левомицетина в кормах животного происхождения с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии

Владельцы патента RU 2633013:

Изобретение относится к ветеринарной токсикологии и может быть использовано при определении содержания левомицетина в кормах животного происхождения. Заявленный способ определения левомицетина в кормах животного происхождения с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии включает отбор пробы корма массой от 200 до 500 мг, гомогенизацию, экстракцию 95% этанолом, фильтрацию экстракта, обезвоживание сернокислым натрием, упаривание, растворение сухого остатка в этилацетате, введение растворенного сухого остатка в жидкостный хроматограф с детектором спектрофотометрическим UVV 104М и колонкой Диасфер-110С-16 (150×4) мм, с размером частиц сорбента 5 мкм, с использованием элюента: смеси ацетонитрил-вода-диэтиламин в соотношении 30:70:0,1, обработку результатов анализа. Технический результат – повышение чувствительности и избирательности способа, а также сокращение длительности проведения анализа. 1 табл.

Изобретение относится к ветеринарной токсикологии и может быть использовано при определении содержания левомицетина в кормах животного происхождения.

Известен способ количественного определения левомицетина в пищевых продуктах и фармпрепаратах, заключающийся в том, что левомицетин переводят из пробы в раствор, проводят кислотный гидролиз и осаждают белок из гидролизата с последующим вольтамперометрическим определением, вольтамперометрическое определение левомицетина осуществляют путем регистрации катодных пиков антибиотика на индикаторном ртутно-пленочном или стеклоуглеродном электроде в дифференциальном режиме съемки вольтамперограмм при соответствующих потенциалах -(0,67±0,05) В и -(0,60±0,03) В относительно насыщенного хлорид-серебряного электрода на фонах 0,1 моль/дм 3 аммония лимоннокислого двузамещенного (рН 4,7-5,1) или 0,1 моль/дм 3 (NH4)2SO4 с добавлением НСl до рН 5,1 при скорости развертки потенциала 10-25 мВ/с и концентрацию левомицетина определяют по высоте пика методом добавок аттестованных смесей [Патент RU №2180748, МПК G01N 27/48, 20.03.2002].

Недостатками известного способа являются низкая чувствительность и длительность проведения анализа.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому способу является определение остаточных количеств левомицетина (Хлорамфеникола, Хлормицетина) в продуктах животного происхождения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, который заключается в отборе проб — 10 г мяса, гомогенизации с 15 см 3 фосфатного буфера (рН=6,88), последующей экстракции 3 раза по 30 см 3 этилацетата. Полученную взвесь центрифугируют 15 мин при 4000 об/мин и декантируют. Этилацетатный слой промывают последовательно 5 см 3 насыщенного раствора NaCl с добавлением 0,2 мл 10% NaOH; 5 см 3 насыщенного раствора NaCl с добавлением 0,2 см 3 10%-ного СН3СООН; 5 см 3 насыщенного раствора NaCl. Органический слой отбирают и упаривают на ротационном испарителе (при 50°С) до возможно минимального объема, отдувают азотом до исчезновения запаха органических растворителей, добавляют 3 см 3 смеси ацетонитрил-вода (1:4) и экстрагируют 3 раза по 5 см 3 петролейным эфиром. Петролейный эфир отбрасывают и извлекают левомицетин экстракцией этилацетатом (3 раза по 5 см 3 ). Этилацетатный слой упаривают досуха, растворяют в 0,1 см 3 метанола. В жидкостной хроматограф с колонкой (Ультрасфер ODS, C18) 5 мкм (250×4,6 мм), УФ-детектором при λ=278 нм, используя элюент ацетонитрил-вода-дециламин (40:60:0,1), вводят 5 мкл стандартного раствора (10 нг/мкл) левомицетина. В тех же условиях вводят метанольный экстракт образца мяса. Проводят обработку результатов. За окончательный результат измерения принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. [Определение остаточных количеств левомицетина (Хлорамфеникола, Хлормицетина) в продуктах животного происхождения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и иммуноферментного анализа. Методические указания. МУК 4.1.1912 — 04 // Сборник методических документов, необходимых для обеспечения применения Федерального закона от 12 июня 2008 г. — №88 ФЗ «Технический регламент на молоко и молочную продукцию». — М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009. — С. 41-47

Недостатками данного метода определения левомицетина является его низкая чувствительность и избирательность, длительность проведения анализа.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение чувствительности и избирательности способа, сокращение длительности проведения анализа.

Технический результат достигается тем, что в способе определения левомицетина в кормах животного происхождения с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии, включающем отбор пробы, гомогенизацию, экстракцию, упаривание, растворение сухого остатка, введение растворенного сухого остатка в хроматограф с использованием элюента, обработку результатов анализа, в качестве пробы берут навеску кормов животного происхождения массой от 200 до 500 мг, экстракцию проводят 95% этанолом, перед упариванием экстракт фильтруют, обезвоживают сернокислым натрием, растворение сухого остатка проводят в этилацетате, в качестве хроматографа используют жидкостной хроматограф с детектором спектрофотометрическим UVV 104М и колонкой Диасфер-110С-16 (150×4) мм, с размером частиц сорбента 5 мкм, в качестве элюента используют смесь ацетонитрил-вода-диэтиламин в соотношении 30:70:0,1.

Уменьшение массы пробы корма животного происхождения позволяет уменьшить объем экстрагента и количество извлекаемых при экстракции коэкстрактивных веществ, исключить этап очистки экстракта, что сокращает потери искомого вещества, ускоряет выпаривание экстрагента, повышает чувствительность и избирательность метода, сокращает продолжительность проведения анализа.

Использование 95% этанола для экстракции повышает чувствительность и избирательность способа. Экстракция 95% этанолом позволяет извлечь максимальное количество левомицетина, так как его растворимость в 95% этаноле выше, чем в этилацетате.

Фильтрация, обезвоживание экстракта сернокислым натрием сокращает продолжительность проведения анализа.

Использование для растворения сухого остатка этилацетата повышает избирательность метода. Кроме того, использование для растворения сухого остатка этилацетата менее опасно, чем использование метанола.

Использование жидкостного хроматографа с детектором спектрофотометрическим UVV 104М и колонкой Диасфер-110С-16 (150×4) мм, с размером частиц сорбента 5 мкм, а также элюента, состоящего из смеси ацетонитрил-вода-диэтиламин в соотношении 30:70:0,1 позволяет получить острый, симметричный пик левомицетина, коэффициент асимметрии которого близок к 1, а также сократить время удерживания в колонке, что повышает чувствительность, избирательность метода и сокращает время проведения анализа.

Способ определения левомицетина в кормах животного происхождения с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии осуществляют следующим образом. Берут, например, 250 мг мясокостной муки, гомогенизируют. Далее экстрагируют 95% этанолом по 5 мл трижды по 20 минут. Отдельные экстракты объединяют, фильтруют через воронку с бумажным фильтром, заполненным безводным сернокислым натрием, в грушевидную колбу для выпаривания, затем упаривают на ротационном испарителе при температуре водяной бани 40°С досуха. Полученный сухой остаток растворяют в 1 мл этилацетата и аликвоту вводят в жидкостный хроматограф «Хромос-ЖХ 301» с детектором спектрофотометрическим UVV 104М и колонкой Диасфер-110С-16 (150×4) мм, с размером частиц сорбента 5 мкм. Рабочая длина волны 278 нм. В качестве элюента используют подвижную фазу ацетонитрил-вода-диэтиламин в соотношении 30:70:01. Скорость потока 500 мкл/мин. Время удерживания левомицетина 5,305 мин. Нижний предел обнаружения 0,005 мг/кг. Проводят обработку результатов анализа. Количество левомицетина в пробе корма животного происхождения (X, мг/кг) рассчитывают по формуле

где X — содержание левомицетина в пробе, мг/кг;

А — количество левомицетина в стандартном растворе, введенном в хроматограф, нг;

S1 — площадь пика стандартного раствора левомицетина, введенного в хроматограф, мм 2 ;

S2 — площадь пика левомицетина в пробе, мм 2 ;

V1 — объем экстракта, введенный в хроматограф, мкл;

V2 — объем экстракта после растворения сухого оcтатка, мл;

Р — навеска анализируемого образца, г.

Метрологическая характеристика способа определения левомицетина в кормах животного происхождения с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии представлена в таблице 1.

Анализ метрологических характеристик свидетельствует о высокой чувствительности и избирательности предлагаемого способа.

Предлагаемый способ определения левомицетина в кормах животного происхождения с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии обеспечивает повышение чувствительности и избирательности за счет уменьшения навески пробы; использования в качестве экстрагента 95% этанола; использования жидкостного хроматографа с детектором спектрофотометрическим UVV 104М и колонкой Диасфер-110С-16 (150×4) мм, с размером частиц сорбента 5 мкм, а также элюента, состоящего из смеси ацетонитрил-вода-диэтиламин в соотношении 30:70:01. Чувствительность предлагаемого способа определения левомицетина повышается в 2 раза.

Предлагаемый способ определения левомицетина в кормах животного происхождения с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии обеспечивает сокращение длительности проведения анализа за счет уменьшения массы пробы корма, проведения фильтрации, обезвоживания экстракта сернокислым натрием, использования жидкостного хроматографа с детектором спектрофотометрическим UVV 104М и колонкой Диасфер-110С-16 (150×4) мм, с размером частиц сорбента 5 мкм, а также элюента, состоящего из смеси ацетонитрил-вода-диэтиламин в соотношении 30:70:01. Длительность проведения анализа предлагаемым способом сокращается в 1,8 раза.

Заявляемый способ определения левомицетина в кормах животного происхождения с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии может быть использован в лабораториях для контроля качества кормов, а также для оценки качества сырья животного происхождения, предназначенного для производства кормов, и определения содержания левомицетина в корме при добавлении в него антибиотика с целью групповой фармакотерапии.

Заявляемый способ определения левомицетина в кормах животного происхождения с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии апробирован в химико-токсикологическом отделе БУ ОО «Омская областная ветеринарная лаборатория».

1. Патент RU №2180748, МПК G01N 27/48, 20.03.2002.

2. Определение остаточных количеств левомицетина (Хлорамфеникола, Хлормицетина) в продуктах животного происхождения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и иммуноферментного анализа. Методические указания. МУК 4.1.1912 — 04 // Сборник методических документов, необходимых для обеспечения применения Федерального закона от 12 июня 2008 г. — №88 ФЗ «Технический регламент на молоко и молочную продукцию». — М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009. — С. 41-47 (прототип).

Способ определения левомицетина в кормах животного происхождения с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии, включающий отбор пробы, гомогенизацию, экстракцию, упаривание, растворение сухого остатка, введение растворенного сухого остатка в хроматограф с использованием элюента, обработку результатов анализа, отличающийся тем, что в качестве пробы берут навеску кормов животного происхождения массой от 200 до 500 мг, экстракцию проводят 95% этанолом, перед упариванием экстракт фильтруют, обезвоживают сернокислым натрием, растворение сухого остатка проводят в этилацетате, в качестве хроматографа используют жидкостной хроматограф с детектором спектрофотометрическим UVV 104М и колонкой Диасфер–110C-16 (150×4) мм, с размером частиц сорбента 5 мкм, в качестве элюента используют смесь ацетонитрил-вода-диэтиламин в соотношении 30:70:0,1.

источник

МУК 4.1.1912-04. Определение остаточных количеств левомицетина (Хлорамфеникола, Хлормицетина) в продуктах животного происхождения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и иммуноферментного анализа

1. Назначение и область применения

3. Отбор и подготовка проб

4. Определение остаточных количеств левомицетина (Хлорамфеникола, Хлормицетина) в продуктах животного происхождения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

4.2. Аппаратура, материалы, реактивы

4.3. Требования техники безопасности при проведении испытаний

4.4. Подготовка к испытанию

4.5. Проведение испытаний методом ВЭЖХ

4.6. Условия хроматографирования (ВЭЖХ)

4.7. Подтверждение наличия левомицетина в образцах

5. Определение хлорамфеникола (левомицетина) в продуктах животного происхождения (молоке, мясе, яйцах) методом иммуноферментного анализа

5.2. Аппаратура, материалы, реактивы

5.3. Характеристика наборов для иммуноферментного определения левомицетина (хлорамфеникола)

5.4. Требования техники безопасности при проведении испытаний

5.5. Проведение испытаний с применением набора ИФА-ХАФ

5.6. Проведение испытаний с применением набора «Ридаскрин Левомицетин»

5.7. Обработка результатов

Разработан: ГУ НИИ питания РАМН

Разработан: МГУ им. М.В. Ломоносова

Принят: Главмосархитектура при Мосгорисполкоме

Издан: Комиссия по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию

Утвержден: Главный государственный санитарный врач Российской Федерации, Первый заместитель Министра здравоохранения Российской Федерации 06.03.2004

источник

научная статья по теме ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ЛЕВОМИЦЕТИНА (ХЛОРАМФЕНИКОЛА) В КОРОВЬЕМ МОЛОКЕ МЕТОДОМ ОБРАЩЕННО-ФАЗОВОЙ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ Химия

Авторы работы:

Научный журнал:

Текст научной статьи на тему «ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ЛЕВОМИЦЕТИНА (ХЛОРАМФЕНИКОЛА) В КОРОВЬЕМ МОЛОКЕ МЕТОДОМ ОБРАЩЕННО-ФАЗОВОЙ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ»

ЖУРНАЛ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2013, том 68, № 2, с. 203-207

ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ЛЕВОМИЦЕТИНА (ХЛОРАМФЕНИКОЛА) В КОРОВЬЕМ МОЛОКЕ МЕТОДОМ ОБРАЩЕННО-ФАЗОВОЙ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

© 2013 г. В. Ю. Орлов, А. С. Лебедев

Ярославский государственный университет им. П.Г. Демидова, факультет биологии и экологии

150000Ярославль, пр-д Матросова, 9 Поступила в редакцию 27.02.2012 г., после доработки 05.07.2012 г.

Разработана чувствительная, селективная, точная и надежная методика определения остаточных количеств левомицетина (хлорамфеникола) в сыром и пастеризованном коровьем молоке, включающая фильтрование образца, очистку образца твердофазной экстракцией, очистку элюата жидкостной экстракцией, концентрирование упариванием под вакуумом и определение обращенно-фазовой ВЭЖХ с детектированием при 278 нм. Подвижная фаза — смесь (15 : 85, по объему) ацетонитрила и воды, содержащей 1 об. % пропанола-2. Предел обнаружения 0.45 мкг/кг, предел количественного определения 1.40 мкг/кг, предел повторяемости 6.93%.

Ключевые слова: левомицетин, хлорамфеникол, обращенно-фазовая ВЭЖХ, пастеризованное коровье молоко, сырое коровье молоко.

Левомицетин — антибиотик, активный в отношении как грамположительных, так и грамотри-цательных бактерий и некоторых вирусов [1, 2]. Жесткий контроль содержания левомицетина в пищевых продуктах обусловлен широким спектром побочных воздействий на организм человека. Систематическое поступление этого антибиотика в организм может вызывать дисбактериозы, аллергические реакции, нарушать микрофлору кишечника, деятельность некоторых ферментов. Длительный прием способствует распространению устойчивых форм микроорганизмов. Следует также учитывать вероятность негативного влияния левомицетина на ряд технологических процессов при изготовлении кисломолочных продуктов [2]. Угнетение микроорганизмов закваски может изменить их органолептические и физико-химические свойства. Антимикробный эффект левомицетина вызван способностью подавлять синтез белка, присоединяясь к А-участку 508 субъединицы бактериальной рибосомы [3, 4].

В соответствии с Федеральным законом № 88 «Технический регламент на молоко и молочную продукцию» и СанПиН 2.3.2.1078-01 использование левомицетина в молочных хозяйствах запрещено, а его содержание в молоке и молочных продуктах допускается до 10 мкг/кг [5, 6]. Исходя из этого, методика идентификации и определе-

ния должна обладать достаточно высокой чувствительностью, чтобы обнаруживать концентрацию аналита по крайней мере на уровне 5 мкг/кг, что соответствует половине регламентируемой ПДК. Более того, необходимо чтобы методика позволяла отделять анализируемое соединение от мешающих компонентов матрицы, т.е. была селективна. Не менее важна точность методики, которая позволяет не только определять концентрации левомицетина в образцах, близкие к истинному значению, но и исключать возможность получения ложноположительных и ложноотри-цательных результатов. Методика должна быть надежной, т.е. есть способной в течение длительного времени сохранять определенные параметры в необходимых пределах. Существующая методика определения лемомицетина в пищевых продуктах ВЭЖХ [2] отвечает этим требованиям только частично.

Существует ряд методов, позволяющих определять левомицетин в матрицах различного состава [2, 7—16]. Преимущественно это методы газовой и жидкостной хроматографии. Также применяют тонкослойную хроматографию (ТСХ) и иммуноферментный анализ (ИФА). ИФА [2] позволяет обнаружить левомицетин на достаточно низком уровне 0.08 мкг/кг, однако требует дорогостоящих реактивов, градуировки перед каждой

сериеи анализов и проведения испытания в течение короткого промежутка времени. Метод ТСХ [14] характеризуется высоким пределом обнаружения по сравнению с хроматографическими методами — 1.00 мкг/кг. Он требует длительной и трудоемкой пробоподготовки, включающей многократную жидкость-жидкостную экстракцию, центрифугирование, концентрирование, получение производных и сопровождается значительными потерями аналита.

Наиболее точными и чувствительными являются методы газовой и высокоэффективной жидкостной хроматографии [2, 7—13, 15]. При реализации методов газовой хроматографии требуется предварительное получение летучих силилиро-ванных производных левомицетина [15]. Сигнал регистрируют либо детектором электронного захвата (ДЭЗ) благодаря наличию двух атомов хлора в молекуле аналита, либо масс-селективным детектором (МСД). Пределы обнаружения при применении ДЭЗ у разных авторов находились в диапазоне 0.05-1.00 мкг/кг, для МСД — 0.02-0.60 мкг/кг [15].

Описанные методики ВЭЖХ [2, 7-13, 15, 16] выполняли на обращенно-фазовом сорбенте с МСД и детектированием в УФ-области спектра. При определении нет необходимости в получении производных, однако использование спектро-фотометрического (СФД) или диодно-матричного (ДМД) детекторов требует многоступенчатой пробоподготовки из-за их низкой селективности. МСД решает проблему селективности, одновременно повышая чувствительность, однако его стоимость часто достигает уровня полноценной системы для жидкостной хроматографии. Пределы обнаружения для СФД и ДМД находились в диапазоне 0.65-50.00 мкг/кг, для МСД — 0.003-0.100 мкг/кг [2, 7-13, 15, 16].

Цель данной работы — разработка чувствительной, селективной, точной, надежной, соответствующей современным требованиям нормативных документов [5, 6], методики определения остаточных количеств левомицетина в сыром и пастеризованном коровьем молоке методом об-ращенно-фазовой ВЭЖХ.

возможностью смешивания до трех компонентов подвижной фазы, автоматическим пробоотборником с диапазоном ввода образца от 0.1 до 100 мкл, термостатом колонок, спектрофотометрическим детектором, позволяющим регистрировать аналитические сигналы на четырех длинах волн одновременно, и хроматографической рабочей станцией Chromeleon 6.80. УФ-спектр спиртового раствора левомицетина получали на спектрофотометре UNICO 2802PC.

Подготовка образцов. Молоко является сложной коллоидной полидисперсной системой, в состав которой входит до 200 различных химических соединений [17] как органической, так и неорганической природы, что требует тщательной очистки образца от мешающих компонентов и выбора условий разделения. Образцы молока отбирались согласно ГОСТ 26809-86 [18]. Образец пастеризованного молока или молока-сырья предварительно дважды пропускали через слой гигроскопической ваты. Для анализа отбирали 10 мл пробы и пропускали через предварительно подготовленный патрон Диапак С16. Белки и гидрофильные соединения элюировали 5 мл дистиллированной воды, жир и другие гидрофобные компоненты удаляли 5 мл гексана. Левоми-цетин с патрона элюировали 15 мл хлороформа, элюат упаривался в роторном испарителе досуха при температуре водяной бани не выше 45°C, концентрат растворяли в 1 мл смеси ацетонитри-ла, воды и изопропанола и очищали от остатков жира и гидрофобных соединений двукратной экстракцией по 1 мл гексана. Полученный раствор хроматографировали.

Для оценки степени извлечения левомицетина к 9 мл образца добавляли 1 мл водного раствора левомицетина с концентрацией 100 мкг/л (предельная допустимая концентрация левомицетина составляет 10 мкг/л). Образец с добавкой подвергали всем этапам пробоподготовки и хроматогра-фировали. Степень извлечения рассчитывали по формуле:

Реактивы. В качестве стандартного образца использовали левомицетин РСО 9348-152-00494189 (99.15% основного вещества). В работе применяли ацетонитрил ос.ч., 3 сорт (НПК «Криохром»), пропанол-2, н-гексан, хлороформ х.ч. (ЗАО «Экос-1»), спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья «Экстра» по ГОСТ Р 51652.

Оборудование. Хроматографическое определение проводили на хроматографической системе иШМа1е-3000 фирмы Dionex, укомплектованной вакуумным дегазатором, градиентным насосом с

где сх — концентрация левомицетина в образце с добавкой, полученная по градуировочному графику (мкг/л); cst — концентрация раствора левомицетина, введенного в образец (100 мкг/л).

Условия хроматографического определения:

предколонка (10 х 2.1 мм) Acclaim 120 (С18-фаза, 5 мкм, 120 А); колонка (150 х 2.1 мм) Acclaim 120 (С18-фаза, 3 мкм, 120 А); подвижная фаза ацетонитрил — 1.0%-ный (по объему) водный раствор пропанола-2 в объемном соотношении (15 : 85), режим элюирования изократический; расход подвижной фазы 0.2 мл/мин; температура термостата

ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ

колонок 30.0°С; объем пробы 40 мкл; длина волны детектора 278 нм, контроль при 254 нм.

Время удерживания левомицетина 27.7—28.6 мин.

Определение проводили методом внешнего стандарта. Из спиртового раствора левомицетина с концентрацией 100 мг/л готовили рабочий стандартный водный раствор с концентрацией 1000 мкг/л. Растворы для построения градуиро-вочного графика с концентрациями 50, 100, 250, 500 и 750 мкг/л готовили разбавлением стандартного раствора в мерных колбах вместимостью 10 мл подвижной фазой. Градуировочные растворы и рабочий стандартный раствор хроматогра-фировали в тех же условиях, что и исследуемые образцы молока. Для построения градуировочно-го графика готовили три серии растворов (всего 18 точек). Градуировочный график описывается уравнением y = 0.0063 + 0.0062х, где y — площадь пика, х — концентрация, мкг/л, с коэффициентом корреляции r2 = 0.99991.

УФ-спектр спиртового раствора с концентрацией 10 мг/л снимали относительно этанола в диапазоне 380—190 нм с шагом сканирования 1 нм в кюветах с l = 10 мм.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ

Выбор условий подготовки образцов и хромато-графического анализа. Необходимый уровень чувствительности методики достигали путем концентрирования аналита на патроне для твердофазной экстракции из 10 мл образца, упариванием элюата, введением в хроматограф большого объема пробы (40 мкл) и регистрацией аналитического сигнала в максимуме поглощения левомицетина. Спектр поглощения аналита имеет два максимума поглощения — при 216 и 278 нм (рис. 1).

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

КАРПОВ С.И., СЕЛЕМЕНЕВ В.Ф., ЧИРКИН В.А., ШУМСКИЙ Н.И. — 2013 г.

АМЕЛИН В.Г., ВОЛКОВА Н.М., НИКЕШИНА Т.Б., РЕПИН Н.А. — 2015 г.

ГАСИЛОВА Н.В., ЕРЕМИН С.А. — 2010 г.

АЛТУХОВА А.А., ДУРИЦИН Е.П., КИМ А.В., КОРОЛЕВ В.А., ШОРМАНОВ В.К. — 2010 г.

источник

Наименование документа: МУК 4.1.1912-04
Тип документа: МУК
Статус документа: Действует
Название: Определение остаточных количеств левомицетина (Хлорамфеникола, Хлормицетина) в продуктах животного происхождения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и иммуноферментного анализа
Область применения: Методические указания предназначены для учреждений госсанэпидслужбы Минздрава РФ и других ведомств, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов в соответствии с СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов». Методические указания распространяются на методы с различным целевым назначением (арбитраж, скрининг). Приведены два метода определения остаточных количеств левомицетина (хлорамфеникола, хлормицетина) в продуктах животного происхождения: — высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ); — иммуноферментного анализа (ИФА).
Краткое содержание:
Комментарий: Введены впервые
Дата добавления в базу: 01.09.2013
Дата актуализации: 01.12.2013
Дата введение: 01.05.2004
Доступно сейчас для просмотра: 100% текста. Полная версия документа.
Организации:
Читайте также:  Левомицетин про инструкция по применению