Меню Рубрики

Определение левомицетина в меде

За последние годы антибиотики широко применяют в пчеловодстве для стимулирования пчелиных семей с целью увеличения продуктивности, для лечения больных пчел и профилактики заболеваний. Наиболее часто используют стрептомицин, биомицин и пенициллин.

Литературные данные по использованию антибиотиков с названными целями разноречивы. Одни авторы (П. П. Копаневич, 1967; О. Д. Дмитриев, В. С. Резников, 1968) считают, что применение антибиотиков в стимулирующих и профилактических дозах благоприятно отражается на пчелиных семьях, другие (Ст. Недялков, 1969) сообщают, что эти дозы сокращают жизнь пчел.

Исследования по влиянию антибиотиков на рабочих пчел и маток и по выявлению сроков сохранения антибиотиков в пищевых запасах пчелиных семей и товарном меде проведены в Болгарии. Л. Арсенов (1968) сообщил, что в пчелиных семьях, обработанных с профилактической целью в начале апреля пенициллином и стрептомицином, свыше 50% пчелиных маток в возрасте 8-10 месяцев превратились в трутовок. Д. Ландеркин (1958) установил, что антибиотики длительное время сохраняются в сахарном сиропе и меде при 4°. Наиболее устойчив биомицин, менее устойчив стрептомицин, тетрациклин и особенно пенициллин. Он терял активность в меде при 34° в течение одного месяца, а при температуре 4° — в течение двух месяцев. Д. Савов (1962) также считает, что в пищевых запасах меда в пчелиных семьях, которым скармливали антибиотики с профилактической и лечебной целями, антибиотики сохраняются довольно долго. Например, пенициллин сохраняется до 30 дней, тетрациклин и стрептомицин до 45 дней, а биомицин свыше 5 месяцев. В лабораторных опытах в пробах товарного меда пенициллин сохраняется при 15-22° в течение одного месяца, а биомицин, тетрациклин и стрептомицин около 8 месяцев.

В медах, поступивших на рынки г. Москвы, В. И. Головнев (1970) выявил хлортетрациклин в 5,7% случаев, а стрептомицин в 8,5% случаев. Он же установил, что хлортетрациклин и стрептомицин при скармливании пчелиным семьям сохраняются в меде в условиях улья свыше 12 месяцев, а в товарном меде при хранении его в условиях комнатной температуры свыше 15 месяцев.

Широкое и бесконтрольное применение антибиотиков на пасеках приводит к возникновению резистентных рас бактерий, а это ведет к тому, что болезни пчел не ликвидируются полностью, а только заглушаются на какое-то время и приобретают стертое течение.

Употребление с медом активного антибиотика приводит к возникновению токсических явлений, аллергических реакций, образованию устойчивых форм патогенных и непатогенных бактерий в организме человека (Г. Я. Кивман, 1956; А. Л. Либов, 1958; А. М. Смирнов, 1969).

Все вышесказанное вызывает необходимость определятъ содержание этих веществ в товарном меде и разработать санитарно-гигиенические меры, способствующие исключению из потребления людьми меда, содержащего антибиотики.

В настоящее время остаточные количества антибиотиков в пищевых продуктах определяют микробиологическими методами (метод диффузии в агар). Методики по выявлению антибиотиков в меде нет. Группа специалистов разработала методику по выявлению минимальных количеств стрептомицина и меде. Они изучили антибактериальные свойства меда различного происхождения, условия их проявления и устранения; выяснили длительность сохранения стрептомицина и товарном меде, полученного от пчелиных семей, подвергнутых лечению данным антибиотиком; испытали термоустойчивость стрептомицина в меде.

Вначале они установили антибактериальные свойства меда, что позволило им перейти к определению стрептомицина в меде. Исследовали образцы меда (медосбор 1965 г.), полученные с пасек, где пчелам скармливали стрептомицин из расчета 500 000 ЕД на 2-3 л сахарного сиропа. Мед был исследован после 3,5 лет хранения при температуре 18-20°. Кроме того, исследовали мед, в который вносили заведомо известные концентрации стрептомицина (1; 1,5; 0,15 ЕД на 1 г меда), через 7, 14, 21 день и два месяца хранения при комнатной температуре.

источник

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ

Цели и принципы стандартизации е Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. № 184-ФЗ «О техническом регулировании», а правила применения национальных стандартов Российской Федерации — ГОСТ Р 1.0—2004 «Стандартизация Российской Федерации. Основные положения»

1 РАЗРАБОТАН Государственным научным учреждением Научно-исследовательским институтом пчеловодства Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ НИИ пчеловодства Россель-хоэакадемии) и Обществом с ограниченной ответственностью «Аналитический центр Апис»

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом ло стандартизации ТК432 «Пчеловодство»

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН 8 ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 13 декабря 2011 г. N9 804-ст

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». а текст изменений и поправок — е ежемесячно издаваемых информационных указателях «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандартыда. Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства ло техническому регулированию и метрологии

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МЕД НАТУРАЛЬНЫЙ Метод определения антибиотиков

Natural honay. Method for determination of antibiotics

Настоящий стандарт распространяется на натуральный мед и устанавливает метод определения остаточных количеств антибиотиков тетрациклиновой группы и лееомицетина (хлорамфеникола) (да* лее — ХАФ) на основе твердофазного иммукоферментного анализа (далее — ИФА).

Пределы обнаружения составляют:

• для тетрациклина, ролитетрацикпина — 6 мкг/кг,

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р 12.1.019—2009 Система стандартов безопасности труда. Электробезоласность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ Р ИСО 5725*1—2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения

ГОСТ Р ИСО 5725*6—2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов из* мерений. Часть 6. Использование значений точности на практике

ГОСТ Р 51568—99 (ИСО 3310-1-90) Сита лабораторные из металлической проволочной сетки. Технические условия

ГОСТ Р 52501—2005 (ИСО 3696:1987) Вода для лабораторного анализа. Технические условия ГОСТ Р 53228—2008 Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 12.1.004—91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.007—76 Система стандартов безопасности труда, вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.4.009—63 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 1770—74 (ИСО 1042—83. ИСО 4788—80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры. мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3145—84 Часы механические с сигнальным устройством. Общие технические условия

ГОСТ 4233—77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия

ГОСТ 4328—77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 12026—76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 14919—63 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 16317—87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 19792—2001 Мед натуральный. Технические условия

ГОСТ 19861—74 Анализаторы потенциометрические для контроля pH молока и молочных продуктов. Общие технические условия

ГОСТ 25336—82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии а сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылке на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

В настоящем стандарте применены термины по ГОСТ 19792. ГОСТ Р ИСО 5725-1. а также следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 антибиотики: Широкий спектр антимикробных ветеринарных препаратов (в т. ч. тетрацикли-ны. левомицетик). используемых для профилактики и лечения инфекционных заболеваний пчел.

3.2 остаточное количество антибиотика в меде: Массовая доля остатка антибиотика а меде, выражают в микрограммах на килограмм.

3.3 иммукоферментный анализ; ИФА (enzyme-linked immunosorbent assay: EUSA): Лабораторный иммунологический метод качественного определения и количественного измерения антигенов и антител.

4.1 Требования электробезопасности при работе с приборами — по ГОСТ Р 12.1.019.

4.2 Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.

4.3 При выполнении анализов необходимо соблюдать требования безопасности при работе с химическими реактивами согласно ГОСТ 12.1.007.

5.1 Отбор проб — по ГОСТ 19792.

5.2 Закристаллизованный мед размягчают на водяной бане, предназначенной для равномерного обогрева с помощью трубчатых электрических нагревательных элементов мощностью не более 1000 Вт. напряжение сети 220 В. диапазон регулировки температуры от 20 *С до 100 *С или в сушильном шкафу по ГОСТ 14919 при температуре не выше 40 ®С и продавливают металлическим или пластмассовым шпателем с длиной рабочей поверхности не менее 20 мм через сито по ГОСТ Р 51568. Крупные механические частицы удаляют вручную.

5.3 Сотовый мед распечатывают, отделяют от сот сломощью металлического сита без нагревания.

Базовым принципом для количественного определения антибиотиков тетрациклиновой группы в меде является твердофазный конкурентный ИФА на планшетах из полистирола. Метод основан на конкуренции свободного антибиотика из меда и антибиотика, предварительно адсорбированного на твердой фазе (лунке планшета) в составе белкового конъюгата, за центры связывания специфичных к

тетрациклинам антител во вносимом растворе. После отделения несвязавшихся реагентов количество антител, прореагировавших с иммобилизованным антигеном, определяют с помощью вторичных анти-видовых антител, меченных пероксидаэой хрена. Количество связавшегося с антителами конъюгата вторичных антител определяют с помощью субстрат-хромогенной смеси. Количество определяемого антибиотика, содержащегося в анализируемой пробе, обратно пропорционально регистрируемой оптической плотности продукта ферментативной реакции.

6.2 Средства измерений, вспомогательные устройства, посуда, материалы и реактивы

6.2.1 Фотометр микролланшетный вертикального сканирования с фильтрами, соответствующими длине волны 450 нм.

6.2.2 Дозаторы пипеточные автоматические с переменным объемом дозирования 0,010—0.100 см 3 ; 0.100—1,000 см 3 и 1.000—5.000 см 3 одноканальные.

6.2.3 Дозаторы пипеточные автоматические восьмиканальные с переменным объемом дозирова* ния 0.050—0.300 см 3 .

6.2.4 Наконечники для автоматических пипеток вместимостью от 0.300 до 1,000 и до 5.000 см 3 однократного применения.

6.2.5 Анализатор потенциометрический с пределом допускаемой основной погрешности измерений ± 0.01 ед. pH по ГОСТ 19861.

6.2.6 Весы по ГОСТ Р 53228. с пределами допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более ± 0.1 мг и не более ± 0.002 г.

6.2.7 Шейкер лабораторный для пробирок.

6.2.8 Часы механические с сигнальным устройством по ГОСТ 3145.

6.2.9 Центрифуга настольная с эффективностью не менее 3000 g или иного типа с теми же характеристиками.

6.2.10 Ультразвуковая ванна с эффективной мощностью ультразвука 60 Вт.

6.2.11 Аппарат универсальный для встряхивания.

6.2.12 Стаканы химические вместимостью 50.100 см 3 по ГОСТ 25336.

6.2.13 Колбы мерные вместимостью 1000 см 3 по ГОСТ 1770.

6.2.14 Цилиндры мерные 2-25-1 по ГОСТ 1770.

6.2.15 Набор реагентов для количественного определения тетрациклина типа «Ридаскрин Тетрациклин».

6.2.16 Натрий фосфорнокислый 2-эамешенный 2-водный. с массовой долей основного вещества не менее 98 %.

6.2.17 Натрий фосфорнокислый 1-эамещекный 1-водный. с массовой долей основного вещества не менее 98 %.

6.2.18 Натрий хлористый по ГОСТ 4233.

6.2.19 Натрия гидроокись по ГОСТ 4328.

6.2.20 8ода для лабораторного анализа категории 1 по ГОСТ Р 52501.

6.2.22 Стеклянные виалы вместимостью 1,5. 80 см 3 с завинчивающимися крышками.

6.2.23 Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.

6.2.24 Термостат или другое устройство, позволяющее производить равномерный нагрев до температуры 40 ‘С.

6.3 Характеристика набора для иммуноферментного определения тетрациклинов

Для иммуноферментного определения тетрациклинов применяют промышленно изготовленные наборы, характеристики которых должны быть не ниже указанных в 6.3.1.

6.3.1.1 Планшет микротитровальный на 96 лунок (12 стрипов по 8 лунок), сенсибилизированных препаратом тетрациклина. — 1 шт.

6.3.1.2 Комплект стандартных растворов тетрациклина со следующими массовыми концентрациями 0; 1.5:4.5:13,5; 40.5; 121.5 нг/см 3 в водном растворе по 1.3 см 3 — 6 флаконов.

6.3.1.3 Раствор антител —6.0 см 3 .

6.3.1.4 Конъюгат вторичных антител с пироксидаэой — 10.0 см 3 .

6.3.1.5 Субстрат/хромоген. содержащий пероксид карбамида (мочевины) и тетраметилбензи* дин. —10.0 см 3 .

6.3.1.6 Стоп-реагент, содержащий 1 Н серную кислоту,— 14.0 см 3 .

6.3.1.7 Буфер 1 для разбавления стандартных растворов тетрациклина и растворов образ* цов — 50.0 см 3 .

6.3.1.8 Смесь солей для приготовления 1 дм 3 моющего буфера.

Примечание — Набор рассчитан на проведение 48 определений в двух повторностях, включая анализируемые пробы и калибровочные растворы (всего 96 определений не один плвншет).

6.3.2 Аналитические характеристики набора

6.3.2.1 Специфичность метода

Метод анализа при использовании набора характеризуется показателем специфичности, составляющим для:

тетрациклина —100 %; ролитетрациклина —100 %; хлортетрациклина — 42 %; демеклоциклина — 27 %; окситетрациклина —13 %; доксициклина — 8 %.

6.3.2.2 Чувствительность метода Пределы обнаружения:

— тетрациклина, ролитетрациклина — 6 мкг/кг;

— хлортетрациклина — 15 мкг/кг.

• окситетрациклина — 50 мкг/кг;

Показатель извлекаемости тетрациклина из меда — (107 ±11) %.

6.3.3 Рекомендации по использованию наборов

6.3.3.1 При проведении испытаний следует использовать реагенты и компоненты, входящие в один и тот же набор. Разбавление или замена реагентов, использование реагентов из набора с другим номером партии могут привести к потере чувствительности или ошибке определения.

6.3.3.2 Необходимо хранить наборы при температуре 2 *С—8 ®С.

Не допускается хранение при отрицательной температуре и замораживание реагентов набора. Для хранения неиспользованных стрилов (лунок) их герметично упаковывают в оригинальный фольги-рованный пакет вместе с имеющимся осушителем.

6.3.3.3 Необходимо избегать попадания прямых солнечных лучей на флакон с раствором хромогена из-за его светочувствительности.

6.3.3.4 Раствор хромогена подкрашен в розовый цвет для удобства использования. В случае окрашивания раствора хромогена в голубой цвет его применение для анализа не допускается, поскольку такое окрашивание раствора хромогена является признаком порчи.

6.3.3.5 Сроки хранения отдельных компонентов набора указаны на упаковке.

6.3.4 Требования техники безопасности при проведении определений

6.3.4.1 Стандартные растворы содержат тетрациклин, поэтому требуется особая осторожность.

6.3.4.2 Стоп-реагент содержит серную кислоту, поэтому следует избегать контакта стол-реагента с кожей.

6.4 Проведение испытаний с применением набора

6.4.1 Отбор и подготовка проб меда — по разделу 5.

6.4.2 Приготовление раствора натрия гидроокиси молярной концентрации 0.1 моль/дм 3 (4.00 ± 0.01) г натрия гидроокиси по 6.2.19 взвешивают в стакане вместимостью 100 см 3 по 6.2.12,

растворяют в 75 см 3 воды для лабораторного анализа по 6.2.20, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см 3 по 6.2.13, доводят до метки водой и тщательно перемешивают.

6.4.3 Приготовление фосфатного буфера 1 молярной концентрацией 20 ммоль/дм 3 для разбавления стандартных растворов тетрациклина и растворов образцов

(0,55 ± 0.01) г натрия фосфорнокислого 1-эамещенкого 1-водного по 6.2.17 взвешивают в стакане вместимостью 50 см 3 по 6.2.12. растворяют в 25 см 3 воды для лабораторного анализа, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см 3 . Аналогично взвешивают и растворяют (2.85 ± 0,01) г натрия фосфорнокислого 2-эа мешенного 2-еодного по 6.2.16 и (9.00 ±0.01) г натрия хлористого по 6.2.18. оба раствора количественно переносят в ту же мерную колбу. В ту же колбу добавляют 800 см 3 воды для лабораторного анализа. Раствор тщательно перемешивают. Измеряют значение pH приготовленного раствора, которое должно составлять 7.4 ед. pH. В случае несоответствия значения pH довести его до требуемой величины добавлением в мерную колбу 0.1 Н раствора гидроокиси натрия по 6.4.2. Раствор доводят до метки водой и тщательно перемешивают.

Срок хранения буферного раствора при температуре 6 ®С—10 ®С — не более одного года.

6.4.4 Приготовление моющего буферного раствора с тайном 20

Фосфатный буферный раствор готовят по 6.4.3. Количественно переносят 500 см 3 в мерную колбу вместимостью 1000 см 3 . Дополнительно в мерную колбу добавляют 0.5 см 3 теина 20 по 6.2.21. доводят водой до метки и тщательно перемешивают.

Срок хранения раствора при температуре 6 °С—10 «С — не более одного года.

6.4.5 Приготовление анализируемой пробы

Взвешивают (1,00 ± 0,001) г меда, подготовленного по разделу 5, в стеклянной виале вместимостью 80 см 3 . Добавляют (49.00 ± 0,001) г фосфатного буфера 1 по 6.4.3 и тщательно завинчивают крышку виалы. 8иалу помещают в ультразвуковую ванну по 6.2.10 на 5 мин. Затем раствор интенсивно перемешивают на шейкере по 6.2.7 в течение 2 мин. Перед анализом встряхивают пробы вверх-вниз.

6.4.6 Приготовление реагентов для анализа

Перед использованием набора довести температуру всех реагентов до комнатной в пределах 20 *С—25 «С. а после использования охладить все оставшиеся реагенты до температуры 2 в —8 *С в холодильных приборах по ГОСТ 16317.

В процессе выполнения анализа нельзя допускать высыхания лунок планшета. На всех стадиях определения необходимо избегать воздействия прямого солнечного света.

Растворы антител, конъюгата, субстрата/хромогена. стоп-реагента, входящие в состав набора, поставляются в готовом к употреблению виде. Перед употреблением достаточно вскрыть флакон.

6.4.7 Приготовление стандартных растворов

Подготовку стандартных растворов проводят только в одноразовых стеклянных виалах вместимостью 1,5 см 3 .

Для подготовки к использованию стандартных растворов тетрациклина концентраты стандартных растворов, входящих в состав набора, разбавляют буфером 1 (таблица 1). После разбавления необходимо тщательно перемешать готовые растворы.

После каждой серии определений необходимо готовить свежие стандартные растворы.

Построение градуировочной кривой необходимо проводить для каждой серии определений.

Таблице 1 — Приготовление стандартных растворов тетрациклине

Номер концентрате стандарта

Массовая концентрация разбавленного стандарта. маг/дм 3

источник

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Метод определения антибиотиков

Natural honey. Method for determination of antibiotics

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ «О техническом регулировании», а правила применения национальных стандартов Российской Федерации — ГОСТ Р 1.0-2004 «Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения»

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Государственным научным учреждением Научно-исследовательским институтом пчеловодства Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ НИИ пчеловодства Россельхозакадемии) и Обществом с ограниченной ответственностью «Аналитический центр Апис»

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 432 «Пчеловодство»

4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячно издаваемых информационных указателях «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

Настоящий стандарт распространяется на натуральный мед и устанавливает метод определения остаточных количеств антибиотиков тетрациклиновой группы и левомицетина (хлорамфеникола) (далее — ХАФ) на основе твердофазного иммуноферментного анализа (далее — ИФА).

Читайте также:  Левомицетина натрия сукцинат аналоги

Пределы обнаружения составляют:

— для тетрациклина, ролитетрациклина — 6 мкг/кг,

— левомицетина — 0,025 мкг/кг.

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р 12.1.019-2009 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения

ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике

ГОСТ Р 51568-99 (ИСО 3310-1-90) Сита лабораторные из металлической проволочной сетки. Технические условия

ГОСТ Р 52501-2005 (ИСО 3696:1987) Вода для лабораторного анализа. Технические условия

ГОСТ Р 53228-2008 Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3145-84 Часы механические с сигнальным устройством. Общие технические условия

ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия

ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 14919-83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 19792-2001 Мед натуральный. Технические условия

ГОСТ 19881-74 Анализаторы потенциометрические для контроля рН молока и молочных продуктов. Общие технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

В настоящем стандарте применены термины по ГОСТ 19792, ГОСТ Р ИСО 5725-1, а также следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 антибиотики: Широкий спектр антимикробных ветеринарных препаратов (в т.ч. тетрациклины, левомицетин), используемых для профилактики и лечения инфекционных заболеваний пчел.

3.2 остаточное количество антибиотика в меде: Массовая доля остатка антибиотика в меде, выражают в микрограммах на килограмм.

3.3 иммуноферментный анализ; ИФА (enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA): Лабораторный иммунологический метод качественного определения и количественного измерения антигенов и антител.

4.1 Требования электробезопасности при работе с приборами — по ГОСТ Р 12.1.019.

4.2 Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.

4.3 При выполнении анализов необходимо соблюдать требования безопасности при работе с химическими реактивами согласно ГОСТ 12.1.007.

5.2 Закристаллизованный мед размягчают на водяной бане, предназначенной для равномерного обогрева с помощью трубчатых электрических нагревательных элементов мощностью не более 1000 Вт, напряжение сети 220 В, диапазон регулировки температуры от 20 °С до 100 °С или в сушильном шкафу по ГОСТ 14919 при температуре не выше 40 °С и продавливают металлическим или пластмассовым шпателем с длиной рабочей поверхности не менее 20 мм через сито по ГОСТ Р 51568. Крупные механические частицы удаляют вручную.

5.3 Сотовый мед распечатывают, отделяют от сот с помощью металлического сита без нагревания.

6.1 Сущность метода

Базовым принципом для количественного определения антибиотиков тетрациклиновой группы в меде является твердофазный конкурентный ИФА на планшетах из полистирола. Метод основан на конкуренции свободного антибиотика из меда и антибиотика, предварительно адсорбированного на твердой фазе (лунке планшета) в составе белкового конъюгата, за центры связывания специфичных к тетрациклинам антител во вносимом растворе. После отделения несвязавшихся реагентов количество антител, прореагировавших с иммобилизованным антигеном, определяют с помощью вторичных антивидовых антител, меченных пероксидазой хрена. Количество связавшегося с антителами конъюгата вторичных антител определяют с помощью субстрат-хромогенной смеси. Количество определяемого антибиотика, содержащегося в анализируемой пробе, обратно пропорционально регистрируемой оптической плотности продукта ферментативной реакции.

6.2 Средства измерений, вспомогательные устройства, посуда, материалы и реактивы

6.2.1 Фотометр микропланшетный вертикального сканирования с фильтрами, соответствующими длине волны 450 нм.

6.2.5 Анализатор потенциометрический с пределом допускаемой основной погрешности измерений ±0,01 ед. рН по ГОСТ 19881.

6.2.6 Весы по ГОСТ Р 53228, с пределами допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более ±0,1 мг и не более ±0,002 г.

6.2.7 Шейкер лабораторный для пробирок.

6.2.8 Часы механические с сигнальным устройством по ГОСТ 3145.

6.2.9 Центрифуга настольная с эффективностью не менее 3000 g или иного типа с теми же характеристиками.

6.2.10 Ультразвуковая ванна с эффективной мощностью ультразвука 60 Вт.

6.2.11 Аппарат универсальный для встряхивания.

6.2.14 Цилиндры мерные 2-25-1 по ГОСТ 1770.

6.2.15 Набор реагентов для количественного определения тетрациклина типа «Ридаскрин Тетрациклин».

6.2.16 Натрий фосфорнокислый 2-замещенный 2-водный, с массовой долей основного вещества не менее 98%.

6.2.17 Натрий фосфорнокислый 1-замещенный 1-водный, с массовой долей основного вещества не менее 98%.

6.2.19 Натрия гидроокись по ГОСТ 4328.

6.2.20 Вода для лабораторного анализа категории 1 по ГОСТ Р 52501.

6.2.23 Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.

6.2.24 Термостат или другое устройство, позволяющее производить равномерный нагрев до температуры 40 °С.

6.3 Характеристика набора для иммуноферментного определения тетрациклинов

Для иммуноферментного определения тетрациклинов применяют промышленно изготовленные наборы, характеристики которых должны быть не ниже указанных в 6.3.1.

6.3.1 Состав набора *
_______________
* Отработка метрологических характеристик метода проводилась с применением наборов «Ридаскрин Тетрациклин». Данная информация приводится для удобства пользователей настоящего стандарта и не содержит требований применять данный набор.

6.3.1.1 Планшет микротитровальный на 96 лунок (12 стрипов по 8 лунок), сенсибилизированных препаратом тетрациклина, — 1 шт.

6.3.1.8 Смесь солей для приготовления 1 дм моющего буфера.

Примечание — Набор рассчитан на проведение 48 определений в двух повторностях, включая анализируемые пробы и калибровочные растворы (всего 96 определений на один планшет).

6.3.2 Аналитические характеристики набора

6.3.2.1 Специфичность метода

Метод анализа при использовании набора характеризуется показателем специфичности, составляющим для:

тетрациклина — 100%;

ролитетрациклина — 100%;

хлортетрациклина — 42%;

демеклоциклина — 27%;

окситетрациклина — 13%;

доксициклина — 8%.

6.3.2.2 Чувствительность метода

Пределы обнаружения:

— тетрациклина, ролитетрациклина — 6 мкг/кг;

— хлортетрациклина — 15 мкг/кг;

— демеклоциклина — 23 мкг/кг;

— окситетрациклина — 50 мкг/кг;

— доксициклина — 75 мкг/кг.

Показатель извлекаемости тетрациклина из меда — (107±11)%.

6.3.3 Рекомендации по использованию наборов

6.3.3.1 При проведении испытаний следует использовать реагенты и компоненты, входящие в один и тот же набор. Разбавление или замена реагентов, использование реагентов из набора с другим номером партии могут привести к потере чувствительности или ошибке определения.

6.3.3.2 Необходимо хранить наборы при температуре 2 °С — 8 °С.

Не допускается хранение при отрицательной температуре и замораживание реагентов набора. Для хранения неиспользованных стрипов (лунок) их герметично упаковывают в оригинальный фольгированный пакет вместе с имеющимся осушителем.

6.3.3.3 Необходимо избегать попадания прямых солнечных лучей на флакон с раствором хромогена из-за его светочувствительности.

6.3.3.4 Раствор хромогена подкрашен в розовый цвет для удобства использования. В случае окрашивания раствора хромогена в голубой цвет его применение для анализа не допускается, поскольку такое окрашивание раствора хромогена является признаком порчи.

6.3.3.5 Сроки хранения отдельных компонентов набора указаны на упаковке.

6.3.4 Требования техники безопасности при проведении определений

6.3.4.1 Стандартные растворы содержат тетрациклин, поэтому требуется особая осторожность.

6.3.4.2 Стоп-реагент содержит серную кислоту, поэтому следует избегать контакта стоп-реагента с кожей.

6.4 Проведение испытаний с применением набора

6.4.1 Отбор и подготовка проб меда — по разделу 5.

6.4.2 Приготовление раствора натрия гидроокиси молярной концентрации 0,1 моль/дм

(4,00±0,01) г натрия гидроокиси по 6.2.19 взвешивают в стакане вместимостью 100 см по 6.2.12, растворяют в 75 см воды для лабораторного анализа по 6.2.20, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см по 6.2.13, доводят до метки водой и тщательно перемешивают.

6.4.3 Приготовление фосфатного буфера 1 молярной концентрацией 20 ммоль/дм для разбавления стандартных растворов тетрациклина и растворов образцов

(0,55±0,01) г натрия фосфорнокислого 1-замещенного 1-водного по 6.2.17 взвешивают в стакане вместимостью 50 см по 6.2.12, растворяют в 25 см воды для лабораторного анализа, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см . Аналогично взвешивают и растворяют (2,85±0,01) г натрия фосфорнокислого 2-замещенного 2-водного по 6.2.16 и (9,00±0,01) г натрия хлористого по 6.2.18, оба раствора количественно переносят в ту же мерную колбу. В ту же колбу добавляют 800 см воды для лабораторного анализа. Раствор тщательно перемешивают. Измеряют значение рН приготовленного раствора, которое должно составлять 7,4 ед. рН. В случае несоответствия значения рН довести его до требуемой величины добавлением в мерную колбу 0,1 Н раствора гидроокиси натрия по 6.4.2. Раствор доводят до метки водой и тщательно перемешивают.

Срок хранения буферного раствора при температуре 6 °С — 10 °С — не более одного года.

6.4.4 Приготовление моющего буферного раствора с твином 20

Фосфатный буферный раствор готовят по 6.4.3. Количественно переносят 500 см в мерную колбу вместимостью 1000 см . Дополнительно в мерную колбу добавляют 0,5 см твина 20 по 6.2.21, доводят водой до метки и тщательно перемешивают.

Срок хранения раствора при температуре 6 °С — 10 °С — не более одного года.

6.4.5 Приготовление анализируемой пробы

Взвешивают (1,00±0,001) г меда, подготовленного по разделу 5, в стеклянной виале вместимостью 80 см . Добавляют (49,00±0,001) г фосфатного буфера 1 по 6.4.3 и тщательно завинчивают крышку виалы. Виалу помещают в ультразвуковую ванну по 6.2.10 на 5 мин. Затем раствор интенсивно перемешивают на шейкере по 6.2.7 в течение 2 мин. Перед анализом встряхивают пробы вверх-вниз.

6.4.6 Приготовление реагентов для анализа

Перед использованием набора довести температуру всех реагентов до комнатной в пределах 20 °С — 25 °С, а после использования охладить все оставшиеся реагенты до температуры 2 °С — 8 °С в холодильных приборах по ГОСТ 16317.

В процессе выполнения анализа нельзя допускать высыхания лунок планшета. На всех стадиях определения необходимо избегать воздействия прямого солнечного света.

Растворы антител, конъюгата, субстрата/хромогена, стоп-реагента, входящие в состав набора, поставляются в готовом к употреблению виде. Перед употреблением достаточно вскрыть флакон.

6.4.7 Приготовление стандартных растворов

Подготовку стандартных растворов проводят только в одноразовых стеклянных виалах вместимостью 1,5 см .

Для подготовки к использованию стандартных растворов тетрациклина концентраты стандартных растворов, входящих в состав набора, разбавляют буфером 1 (таблица 1). После разбавления необходимо тщательно перемешать готовые растворы.

Таблица 1 — Приготовление стандартных растворов тетрациклина

источник

Мед может быть полезным лишь в случае натуральности и абсолютной доброкачественности. В натуральном меде не должны содержаться вещества, не свойственные его природному составу: токсичные и радиоактивные элементы, остатки лекарственных препаратов.

Для стимулирования пчелиных семей, профилактики и борьбы с болезнями пчел широко используют антибиотики. Их остаточные количества, по имеющимся сведениям, переносятся пчелами в мед и длительное время в нем сохраняются.

Почему это вредно? Даже минимальные концентрации антибиотиков в продуктах пчеловодства при ежедневном их употреблении убивают в организме человека чувствительных к ним бактерий. Однако самые сильные выживают, что приводит к селекции и отбору резистентных к антибиотикам бактерий. Эти бактерии — большая проблема, так как становятся неуязвимыми перед лекарствами. Для борьбы с ними требуются новые, еще более сильные препараты. Бактерии выходят из-под контроля, и производство необходимых антибиотиков превращается во все более трудную задачу. Вот лишь некоторые примеры коварного воздействия антибиотиков: левомицетин тормозит кроветворение, что крайне опасно для жизни человека, когда его организм и так подвержен инфекции; тетрациклины повреждают кости и зубы.

Продолжительность сохранения антибиотика в меде зависит от его природы, происхождения, характера взаимодействия с компонентами продукта, в частности с моно- и дисахаридами. Отдельные антибиотики сохраняются в товарном меде более трех лет. Такой продукт может вызвать аллергические реакции, нарушить баланс кишечной микрофлоры. Возникают устойчивые формы микроорганизмов, и дальнейшее применение антибиотиков с лечебной целью становится неэффективным.

На рынках нашей страны мед реализуют практически без исследования на наличие антибиотиков. Отсутствие необходимого контроля нередко способствует необоснованному использованию различных антибиотиков в пчеловодстве и значительному превышению предусмотренных доз препаратов.

Существует несколько способов определения антибиотиков в меде. Один из них — метод диффузии в агар. Он базируется на способности антибиотиков диффундировать в агар, засеянный тест-микроорганизмами, и препятствовать их росту. Известен также метод тонкослойной хроматографии, основанный на разделении пробы меда в тонком слое сорбента на хроматографических пластинках. Чтобы оценить содержание остаточных количеств препаратов, на эту же пластинку одновременно с пробой меда наносят стандартные растворы антибиотика с известными концентрациями и сравнивают результаты. Оба метода несовершенны: недостаточно чувствительны, исключают возможность получения количественных результатов, длительны в исполнении и т.д.

За последние годы произошло много изменений в отношениях между Россией и ее ближайшими соседями. В связи с образованием Таможенного союза между Белоруссией, Казахстаном и Россией приняты следующие новые документы: «Единые санитарно-эпидемиологические и гигиенические требования к товарам, подлежащим санитарно-эпидемиологическому надзору» и «Единые ветеринарные (ветеринарно-санитарные) требования, предъявляемые к товарам, подлежащим ветеринарному контролю (надзору)». В соответствии с ними в натуральном меде не допускается или ограничивается присутствие ряда лекарственных препаратов, в том числе антибиотиков. При этом речь идет об очень малых количествах препаратов: для левомицетина (хлорамфеникола) отсутствием считается не более 0,3 мкг/кг меда, для антибиотиков тетрациклиновой группы — не более 10 мкг/кг.

Реализация таких жестких требований возможна при утверждении очень точных методов определения указанных веществ. Поэтому в соответствии с планом национальной стандартизации и с целью гармонизации с международными требованиями, предъявляемыми к испытаниям продуктов пчеловодства, и в обеспечение Федерального закона «О техническом регулировании» специалисты ГНУ «НИИ пчеловодства Россельхозакадемии» и ООО «Аналитический центр Апис» разработали национальный стандарт ГОСТ Р 54655–2011 «Мед натуральный. Метод определения антибиотиков».

Метод определения массовых долей антибиотиков тетрациклиновой группы и левомицетина (хлорамфеникола) основан на принципах твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА или ELISA). Пределы обнаружения для тетрациклина, ролитетрациклина составляют 6 мкг/кг, для левомицетина — 0,025 мкг/кг. Диапазон измерений массовых долей антибиотиков, для которых рассчитаны метрологические характеристики, для тетрациклина лежит в пределах 7,5–600 мкг/кг, для левомицетина — 0,075–0,750 мкг/кг.

Суть метода заключается в использовании конкурентного ИФА на планшетах из полистирола. Свободные антибиотики из меда конкурируют с антибиотиками в составе белкового конъюгата, предварительно адсорбированными на твердой фазе (лунке планшета), за ограниченное количество центров связывания антител, специфичных к определенным антибиотикам, во вносимом растворе. После отделения несвязавшихся реагентов количество антител, прореагировавших с иммобилизованным антигеном, для тетрациклинов определяют с помощью вторичных антивидовых антител, меченных пероксидазой хрена, или для левомицетина — без этой стадии. Количество связавшегося с антителами конъюгата определяют с помощью субстрат-хромогенной смеси по изменению цвета раствора в лунке планшета. Количество антибиотика, содержащегося в анализируемой пробе, обратно пропорционально регистрируемой оптической плотности продукта ферментативной реакции.

Стандарт имеет следующие разделы: область применения; нормативные ссылки; термины и определения; требования безопасности; отбор и подготовка проб меда; определение остаточных количеств антибиотиков тетрациклиновой группы; определение остаточных количеств левомицетина (хлорамфеникола). В документе подробно описаны средства измерений, вспомогательные устройства, посуда, материалы и реактивы для выявления указанных антибиотиков.

Наиболее важный фактор иммуноферментного анализа — качество реагентов. Обычно используют промышленно изготовленные наборы с определенными характеристиками. При разработке указанного метода и расчете его метрологических характеристик применяли наборы «Ридаскрин тетрациклин» и «Ридаскрин хлорамфеникол» производства немецкой компании R-Biopharm, отличающиеся высокой надежностью. Каждый набор сертифицирован и снабжен стандартной градуировочной кривой, что очень полезно для контроля качества измерений.

Современные микропланшетные фотометры подключают к компьютеру, что значительно упрощает измерения и регистрацию результатов. Полученные данные обрабатывают с помощью программного обеспечения RIDASOFT Win (но компьютер при этом можно не использовать). Последовательность расчетов и формулы приведены в соответствующих разделах стандарта.

Окончательный результат при определении массовых долей антибиотиков тетрациклиновой группы выражен в микрограммах на килограмм, левомицетина — в нанограммах на килограмм. Для перевода массовой доли левомицетина в микрограммы на килограмм величину в нанограммах на килограмм делят на тысячу.

Статистический анализ результатов испытаний по оценке точности метода проводили в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 5725-6–2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Использование значений точности на практике». Рассчитанные характеристики погрешности и ее составляющие приведены в таблицах этого стандарта.

Применение в лабораториях указанного метода позволит ограничить бесконтрольное использование антибиотиков в пчеловодстве, обеспечит высокое качество меда и, следовательно, повысит его конкурентоспособность.

Т.М.РУСАКОВА, Е.Ю.БАЛАШОВА,
Е.В.АЛЕКСАНДРОВА, Л.А.БУРМИСТРОВА,
В.М.МАРТЫНОВА

источник

Добавил: Богдан Кривошея

Дата: [13.01.2017]

Natural honey. Method for determination of antibiotics

Дата введения — 1 января 2013 г.

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ «О техническом регулировании», а правила применения национальных стандартов Российской Федерации — ГОСТ Р 1.0-2004 «Стандартизация Российской Федерации. Основные положения»

1 Разработан Государственным научным учреждением Научно-исследовательским институтом пчеловодства Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ НИИ пчеловодства Россельхозакадемии) и Обществом с ограниченной ответственностью «Аналитический центр Апис»

2 Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 432 «Пчеловодство»

3 Утвержден и введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 13 декабря 2011 г. N 804-ст

Настоящий стандарт распространяется на натуральный мед и устанавливает метод определения остаточных количеств антибиотиков тетрациклиновой группы и левомицетина (хлорамфеникола) (далее — ХАФ) на основе твердофазного иммуноферментного анализа (далее — ИФА).

Пределы обнаружения составляют:

— для тетрациклина, ролитетрациклина — 6 мкг/кг,

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р 12.1.019-2009 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения

ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике

Читайте также:  Левомицетина актитаб при поносе

ГОСТ Р 51568-99 (ИСО 3310-1-90) Сита лабораторные из металлической проволочной сетки. Технические условия

ГОСТ Р 52501-2005 (ИСО 3696:1987) Вода для лабораторного анализа. Технические условия

ГОСТ Р 53228-2008 Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3145-84 Часы механические с сигнальным устройством. Общие технические условия

ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия

ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 14919-83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 19792-2001 Мед натуральный. Технические условия

ГОСТ 19881-74 Анализаторы потенциометрические для контроля рН молока и молочных продуктов. Общие технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

В настоящем стандарте применены термины по ГОСТ 19792, ГОСТ Р ИСО 5725-1, а также следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 антибиотики: Широкий спектр антимикробных ветеринарных препаратов (в т.ч. тетрациклины, левомицетин), используемых для профилактики и лечения инфекционных заболеваний пчел.

3.2 остаточное количество антибиотика в меде: Массовая доля остатка антибиотика в меде, выражают в микрограммах на килограмм.

3.3 иммуноферментный анализ; ИФА (enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA): Лабораторный иммунологический метод качественного определения и количественного измерения антигенов и антител.

4.1 Требования электробезопасности при работе с приборами — по ГОСТ Р 12.1.019.

4.2 Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.

4.3 При выполнении анализов необходимо соблюдать требования безопасности при работе с химическими реактивами согласно ГОСТ 12.1.007.

5.1 Отбор проб — по ГОСТ 19792.

5.2 Закристаллизованный мед размягчают на водяной бане, предназначенной для равномерного обогрева с помощью трубчатых электрических нагревательных элементов мощностью не более 1000 Вт, напряжение сети 220 В, диапазон регулировки температуры от 20°С до 100°С или в сушильном шкафу по ГОСТ 14919 при температуре не выше 40°С и продавливают металлическим или пластмассовым шпателем с длиной рабочей поверхности не менее 20 мм через сито по ГОСТ Р 51568. Крупные механические частицы удаляют вручную.

5.3 Сотовый мед распечатывают, отделяют от сот с помощью металлического сита без нагревания.

Базовым принципом для количественного определения антибиотиков тетрациклиновой группы в меде является твердофазный конкурентный ИФА на планшетах из полистирола. Метод основан на конкуренции свободного антибиотика из меда и антибиотика, предварительно адсорбированного на твердой фазе (лунке планшета) в составе белкового конъюгата, за центры связывания специфичных к тетрациклинам антител во вносимом растворе. После отделения не связавшихся реагентов количество антител, прореагировавших с иммобилизованным антигеном, определяют с помощью вторичных антивидовых антител, меченных пероксидазой хрена. Количество связавшегося с антителами конъюгата вторичных антител определяют с помощью субстрат-хромогенной смеси. Количество определяемого антибиотика, содержащегося в анализируемой пробе, обратно пропорционально регистрируемой оптической плотности продукта ферментативной реакции.

6.2 Средства измерений, вспомогательные устройства, посуда, материалы и реактивы

6.2.1 Фотометр микропланшетный вертикального сканирования с фильтрами, соответствующими длине волны 450 нм.

6.2.2 Дозаторы пипеточные автоматические с переменным объемом дозирования 0,010 — 0,100 см 3 ; 0,100 — 1,000 см 3 и 1,000 — 5,000 см 3 одноканальные.

6.2.3 Дозаторы пипеточные автоматические восьмиканальные с переменным объемом дозирования 0,050 — 0,300 см 3 .

6.2.4 Наконечники для автоматических пипеток вместимостью от 0,300 до 1,000 и до 5,000 см 3 однократного применения.

6.2.5 Анализатор потенциометрический с пределом допускаемой основной погрешности измерений ±0,01 ед. рН по ГОСТ 19881.

6.2.6 Весы по ГОСТ Р 53228, с пределами допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более ±0,1 мг и не более ±0,002 г.

6.2.7 Шейкер лабораторный для пробирок.

6.2.8 Часы механические с сигнальным устройством по ГОСТ 3145.

6.2.9 Центрифуга настольная с эффективностью не менее 3000 g или иного типа с теми же характеристиками.

6.2.10 Ультразвуковая ванна с эффективной мощностью ультразвука 60 Вт.

6.2.11 Аппарат универсальный для встряхивания.

6.2.12 Стаканы химические вместимостью 50, 100 см 3 по ГОСТ 25336.

6.2.13 Колбы мерные вместимостью 1000 см 3 по ГОСТ 1770.

6.2.14 Цилиндры мерные 2-25-1 по ГОСТ 1770.

6.2.15 Набор реагентов для количественного определения тетрациклина типа «Ридаскрин Тетрациклин».

6.2.16 Натрий фосфорнокислый 2-замещенный 2-водный, с массовой долей основного вещества не менее 98%.

6.2.17 Натрий фосфорнокислый 1-замещенный 1-водный, с массовой долей основного вещества не менее 98%.

6.2.18 Натрий хлористый по ГОСТ 4233.

6.2.19 Натрия гидроокись по ГОСТ 4328.

6.2.20 Вода для лабораторного анализа категории 1 по ГОСТ Р 52501.

6.2.22 Стеклянные виалы вместимостью 1,5, 80 см 3 с завинчивающимися крышками.

6.2.23 Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.

6.2.24 Термостат или другое устройство, позволяющее производить равномерный нагрев до температуры 40°С.

6.3 Характеристика набора для иммуноферментного определения тетрациклинов

Для иммуноферментного определения тетрациклинов применяют промышленно изготовленные наборы, характеристики которых должны быть не ниже указанных в 6.3.1.

6.3.1.1 Планшет микротитровальный на 96 лунок (12 стрипов по 8 лунок), сенсибилизированных препаратом тетрациклина, — 1 шт.

6.3.1.2 Комплект стандартных растворов тетрациклина со следующими массовыми концентрациями 0; 1,5; 4,5; 13,5; 40,5; 121,5 нг/см 3 в водном растворе по 1,3 см 3 — 6 флаконов.

6.3.1.3 Раствор антител — 6,0 см 3 .

6.3.1.4 Конъюгат вторичных антител с пироксидазой — 10,0 см 3 .

6.3.1.5 Субстрат/хромоген, содержащий пероксид карбамида (мочевины) и тетраметилбензидин, — 10,0 см 3 .

6.3.1.6 Стоп-реагент, содержащий 1 Н серную кислоту, — 14,0 см 3 .

6.3.1.7 Буфер 1 для разбавления стандартных растворов тетрациклина и растворов образцов — 50,0 см 3 .

6.3.1.8 Смесь солей для приготовления 1 дм 3 моющего буфера.

Примечание — Набор рассчитан на проведение 48 определений в двух повторностях, включая анализируемые пробы и калибровочные растворы (всего 96 определений на один планшет).

6.3.2 Аналитические характеристики набора

6.3.2.1 Специфичность метода

Метод анализа при использовании набора характеризуется показателем специфичности, составляющим для:

6.3.2.2 Чувствительность метода

— тетрациклина, ролитетрациклина — 6 мкг/кг;

— хлортетрациклина — 15 мкг/кг;

— окситетрациклина — 50 мкг/кг;

Показатель извлекаемости тетрациклина из меда — (107±11)%.

6.3.3 Рекомендации по использованию наборов

6.3.3.1 При проведении испытаний следует использовать реагенты и компоненты, входящие в один и тот же набор. Разбавление или замена реагентов, использование реагентов из набора с другим номером партии могут привести к потере чувствительности или ошибке определения.

6.3.3.2 Необходимо хранить наборы при температуре 2°С — 8°С.

Не допускается хранение при отрицательной температуре и замораживание реагентов набора. Для хранения неиспользованных стрипов (лунок) их герметично упаковывают в оригинальный фольгированный пакет вместе с имеющимся осушителем.

6.3.3.3 Необходимо избегать попадания прямых солнечных лучей на флакон с раствором хромогена из-за его светочувствительности.

6.3.3.4 Раствор хромогена подкрашен в розовый цвет для удобства использования. В случае окрашивания раствора хромогена в голубой цвет его применение для анализа не допускается, поскольку такое окрашивание раствора хромогена является признаком порчи.

6.3.3.5 Сроки хранения отдельных компонентов набора указаны на упаковке.

6.3.4 Требования техники безопасности при проведении определений

6.3.4.1 Стандартные растворы содержат тетрациклин, поэтому требуется особая осторожность.

6.3.4.2 Стоп-реагент содержит серную кислоту, поэтому следует избегать контакта стоп-реагента с кожей.

6.4 Проведение испытаний с применением набора

6.4.1 Отбор и подготовка проб меда — по разделу 5.

6.4.2 Приготовление раствора натрия гидроокиси молярной концентрации 0,1 моль/дм 3

(4,00±0,01) г натрия гидроокиси по 6.2.19 взвешивают в стакане вместимостью 100 см 3 по 6.2.12, растворяют в 75 см 3 воды для лабораторного анализа по 6.2.20, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см 3 по 6.2.13, доводят до метки водой и тщательно перемешивают.

6.4.3 Приготовление фосфатного буфера 1 молярной концентрацией 20 ммоль/дм 3 для разбавления стандартных растворов тетрациклина и растворов образцов

(0,55±0,01) г натрия фосфорнокислого 1-замещенного 1-водного по 6.2.17 взвешивают в стакане вместимостью 50 см 3 по 6.2.12, растворяют в 25 см 3 воды для лабораторного анализа, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см 3 . Аналогично взвешивают и растворяют (2,85±0,01) г натрия фосфорнокислого 2-замещенного 2-водного по 6.2.16 и (9,00±0,01) г натрия хлористого по 6.2.18, оба раствора количественно переносят в туже мерную колбу. В ту же колбу добавляют 800 см 3 воды для лабораторного анализа. Раствор тщательно перемешивают. Измеряют значение рН приготовленного раствора, которое должно составлять 7,4 ед. рН. В случае несоответствия значения рН довести его до требуемой величины добавлением в мерную колбу 0,1 Н раствора гидроокиси натрия по 6.4.2. Раствор доводят до метки водой и тщательно перемешивают.

Срок хранения буферного раствора при температуре 6°С — 10°С — не более одного года.

6.4.4 Приготовление моющего буферного раствора с твином 20

Фосфатный буферный раствор готовят по 6.4.3. Количественно переносят 500 см 3 в мерную колбу вместимостью 1000 см 3 . Дополнительно в мерную колбу добавляют 0,5 см 3 твина 20 по 6.2.21, доводят водой до метки и тщательно перемешивают.

Срок хранения раствора при температуре 6°С — 10°С — не более одного года.

6.4.5 Приготовление анализируемой пробы

Взвешивают (1,00±0,001) г меда, подготовленного по разделу 5, в стеклянной виале вместимостью 80 см 3 . Добавляют (49,00±0,001) г фосфатного буфера 1 по 6.4.3 и тщательно завинчивают крышку виалы. Виалу помещают в ультразвуковую ванну по 6.2.10 на 5 мин. Затем раствор интенсивно перемешивают на шейкере по 6.2.7 в течение 2 мин. Перед анализом встряхивают пробы вверх-вниз.

6.4.6 Приготовление реагентов для анализа

Перед использованием набора довести температуру всех реагентов до комнатной в пределах 20°С — 25°С, а после использования охладить все оставшиеся реагенты до температуры 2° — 8°С в холодильных приборах по ГОСТ 16317.

В процессе выполнения анализа нельзя допускать высыхания лунок планшета. На всех стадиях определения необходимо избегать воздействия прямого солнечного света.

Растворы антител, конъюгата, субстрата/хромогена, стоп-реагента, входящие в состав набора, поставляются в готовом к употреблению виде. Перед употреблением достаточно вскрыть флакон.

6.4.7 Приготовление стандартных растворов

Подготовку стандартных растворов проводят только в одноразовых стеклянных виалах вместимостью 1,5 см 3 .

Для подготовки к использованию стандартных растворов тетрациклина концентраты стандартных растворов, входящих в состав набора, разбавляют буфером 1 (таблица 1). После разбавления необходимо тщательно перемешать готовые растворы.

После каждой серии определений необходимо готовить свежие стандартные растворы.

Построение градуировочной кривой необходимо проводить для каждой серии определений.

источник

Купить ГОСТ Р 54655-2011 — бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО «ЦНТИ Нормоконтроль».

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

  • Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
  • Курьерская доставка (7 дней)
  • Самовывоз из московского офиса
  • Почта РФ

Распространяется на натуральный мед и устанавливает метод определения остаточных количеств антибиотиков тетрациклиновой группы и левомицетина (хлорамфеникола), на основе твердофазного иммуноферментного анализа. Пределы обнаружения составляют: — для тетрациклина, ролитетрациклина — 6 мкг/кг; — левомицетина — 0,025 мкг/кг.

4 Требования безопасности

5 Отбор и подготовка проб ы меда

6 Определение присутствия и массовой доли антибиотиков тетрациклиновой группы

7 Определение присутствия и массовой доли левомицетина (хлорамфеникола, ХАФ)

Чтобы бесплатно скачать этот документ в формате PDF, поддержите наш сайт и нажмите кнопку:

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. № 184-ФЗ «О техническом регулировании», а правила применения национальных стандартов Российской Федерации — ГОСТ Р 1.0-2004 «Стандартизация Российской Федерации. Основные положения»

1 РАЗРАБОТАН Государственным научным учреждением Научно-исследовательским институтом пчеловодства Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ НИИ пчеловодства Россель-хозакадемии) и Обществом с ограниченной ответственностью «Аналитический центр Апис»

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 432 «Пчеловодство»

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 13 декабря 2011 г. № 804-ст

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячно издаваемых информационных указателях «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

7.3.1.2 Комплект стандартных водных растворов ХАФ со следующими массовыми концентрациями 0 (нулевой стандарт); 0,025; 0,050; 0,100; 0,250; 0,750 нг/см 3 по 1,3 см 3 — 6 флаконов.

7.3.1.3 Конъюгат ХАФ с пероксидазой (концентрат) — 0,7 см 3 .

7.3.1.4 Субстрат/хромогеновый раствор (розового цвета) — 10,0 см 3 .

7.3.1.5 Стоп-реагент, содержащий 1 Н серную кислоту, — 14,0 см 3 .

7.3.1.6 Буфер для разбавления конъюгата и растворения образцов — 100,0 см 3 .

7.3.1.7 Моющий буфер (соли) для приготовления 10 мМ фосфатного буфера (7,4 ед. pH), содержащего 0,05 % твина 20.

Примечание — Набор рассчитан на проведение 48 определений в двух повторностях, включая анализируемые пробы и калибровочные растворы (всего 96 определений на один планшет).

7.3.2.1 Чувствительность метода

Предел обнаружения ХАФ в меде — 0,025 мкг/кг.

Предел количественного определения — 0,075 мкг/кг.

Показатель извлекаемости ХАФ из меда — более 80 %.

7.3.3.1 При проведении определений используют реагенты и компоненты, входящие в один и тот же набор. Разбавление или замена реагентов, использование реагентов из набора с другим номером партии могут привести к потере чувствительности или ошибке определения.

7.3.3.2 Необходимо хранить наборы при температуре 2 °С—8 °С в холодильных приборах по ГОСТ 16317. Не допускаются хранение наборов при отрицательной температуре и замораживание реагентов набора.

Для хранения неиспользованных стрипов (лунок) их герметично упаковывают в оригинальный фольгированный пакет вместе с имеющимся осушителем.

7.3.3.3 Необходимо избегать попадания прямых солнечных лучей на флакон с раствором хромогена из-за его светочувствительности.

7.3.3.4 При появлении голубоватого окрашивания розоватого раствора субстрата/хромогена его не применяют, поскольку это признак порчи раствора.

7.3.4.1 Стандартные растворы содержат ХАФ, поэтому требуется особая осторожность.

7.3.4.2 Стоп-реагент содержит в своем составе серную кислоту, поэтому следует избегать контакта стоп-реагента с кожей.

7.4.1 Отбор и подготовка проб меда — по разделу 5.

В мерную колбу вместимостью 100 см 3 количественно переносят содержимое пакета с буферным составом из набора 7.3.1.7. Для растворения солей используют воду для лабораторного анализа по 6.2.20. Раствор доводят до метки водой и тщательно перемешивают.

Срок хранения концентрированного буферного раствора при комнатной температуре 20 °С—25 °С — 12 недель или при температуре 6 °С—10 °С — не более одного года.

Перед анализом в цилиндре смешивают концентрированный фосфатный моющий буфер по 7.4.2 и воду для лабораторного анализа в соотношении 1:9.

Срок хранения рабочего моющего буферного раствора при температуре 2 °С—8 °С — не более 6 недель.

11 Отработка метрологических характеристик метода проводилась с применением наборов «Ридаскрин Хло-рамфеникол». Данная информация приводится для удобства пользователей настоящего стандарта и не содержит требований применять данный набор.

Взвешивают (2,00 ± 0,002) г меда, подготовленного по разделу 5, в центрифужной пробирке вместимостью 15 см 3 по 7.2.4, добавляют 4 см 3 воды для лабораторного анализа. Раствор интенсивно перемешивают на шейкере по 6.2.7 до полного растворения меда.

В пробирку добавляют 4 см 3 этилацетата по 7.2.6, плотно завинчивают крышку и интенсивно встряхивают в течение 10 мин вверх-вниз (или ставят в ультразвуковую ванну).

Пробирку помещают в центрифугу по 6.2.9 для разделения водного и органического слоев. Условия центрифугирования: 10 мин при 3000 д и температуре 20 °С—25 °С.

Дозатором по 6.2.2 отбирают 1 см 3 этилацетатного слоя (что соответствует 0,5 г меда) в чистую круглодонную колбу по 7.2.3 (или виалу по 6.2.2). Органический растворитель удаляют с использованием роторного испарителя или высушиванием в токе азота при температуре 60 °С с использованием микроиспарителя по 7.2.1.

Сухой остаток растворяют в 0,5 см 3 буфера по 7.3.1.6 (из набора) на шейкере (10 мин) и в ультразвуковой ванне (30 мин).

Перед применением набора доводят температуру всех реагентов до комнатной в пределах 20 °С—25 °С, а после использования охлаждают все оставшиеся реагенты до 2 °С—8 °С.

В процессе выполнения анализа нельзя допускать высыхания лунок планшета. На всех стадиях определения следует избегать воздействия прямого солнечного света.

Растворы стандартов ХАФ, субстрата/хромогена, стоп-реагента, входящие в состав набора, поставляются в готовом к употреблению виде. Перед употреблением достаточно вскрыть флакон.

Конъюгат ХАФ с ферментом — концентрат. Так как этот раствор ограниченно стабилен, перед анализом разбавляют только требуемое количество.

Флакон с концентратом аккуратно встряхивают, в одноразовую стеклянную виалу вместимостью 1,5 см 3 дозатором отбирают конъюгат и буфер по 7.3.1.6 (из набора) в соотношении 1:10. Раствор тщательно перемешивают.

На 4 стрипа по 8 лунок достаточно смешать 0,2 см 3 концентрата и 2 см 3 буфера по 7.3.1.6.

Перед выполнением анализа из планшета необходимо извлечь необходимое количество стрипов. Оставшиеся стрипы следует тщательно упаковать в фольгированный пакет вместе с осушителем, герметично закрыть пакет и поместить на хранение при температуре 2 °С—8 °С.

7.4.8.1 В рамку планшета вставляют стрипы (лунки) в количестве, необходимом для выполнения всех запланированных определений (стандартные растворы и образцы) в двух повторностях. Записывают координаты лунок, предназначенных для стандартных растворов и подготовленных исследуемых растворов. Пример формы записи координат лунок представлен на рисунке 2.

Читайте также:  Левомицетина гидрохлорид инструкция по применению

Рисунок 2 — Пример формы записи координат лунок (С — стандартные растворы, П — анализируемые пробы)

7.4.8.2 Одноканальным дозатором по 6.2.2 добавляют по 0,050 см 3 стандартных и анализируемых растворов в соответствующие пары лунок.

7.4.8.3 Восьмиканальным дозатором по 6.2.3 на дно каждой лунки добавляют по 0,050 см 3 разбавленного раствора конъюгата по 7.4.6. Осторожно перемешивают раствор в лунках вручную легкими круговыми движениями рамки планшета по поверхности стола. Ставят в темное место на инкубацию в течение 1 ч при комнатной температуре 20 °С— 25 °С.

7.4.8.4 Резко переворачивают планшет и выливают жидкость из лунок, выбивают капли жидкости, оставшиеся в лунках, путем энергичного трехкратного постукивания рамки с лунками по столу, покрытому фильтровальной бумагой по 6.2.23. Каждую лунку заполняют 0,250 см 3 рабочего раствора моющего буфера по 7.4.3 и вновь удаляют раствор из лунок. Выбивают капли жидкости, как описано выше. Повторяют процедуру промывки лунок моющим буфером еще два раза.

7.4.8.5 Восьмиканальным дозатором добавляют в каждую лунку по 0,100 см 3 раствора субстра-та/хромогена. Тщательно перемешивают растворы в лунках вручную. Ставят в темное место на инкубацию в течение 15 мин при температуре 20 °С—25 °С.

7.4.8.6 Восьмиканальным дозатором в каждую лунку добавляют по 0,100 см 3 стоп-реагента и тщательно перемешивают растворы в лунках вручную. Планшет помещают в микропланшетный фотометр, измеряют оптическую плотность в каждой лунке при 450 нм. Измерения проводят в течение 30 мин после добавления стоп-реагента.

Примечание — При расчете массовой доли левомицитина в анализируемых пробах учитывают фоновый сигнал с помощью постановки холостого опыта. Для этого в каждой серии анализов ставят контрольную пробу без меда, то есть испаряют чистый этилацетат и затем следуют описанной стандартной процедуре. Измененный фоновый сигнал вычитают на стадии обработки результатов.

Построение градуировочной кривой проводят для каждой серии определений.

7.5.1 Для обработки результатов измерений на компьютере используют программное обеспечение RIDASOFT Win. Окончательный результат выражают в нанограммах на килограмм.

Среднее из двух параллельных значений оптической плотности, измеренной в лунках со стандартными или анализируемыми растворами, делят на среднее значение оптической плотности, измеренной в лунках с нулевым стандартом (С1), результат умножают на 100.

Примечание — Если величина оптической плотности, измеренной в лунке с нулевым стандартом, меньше 0,6, то это может быть признаком порчи реагентов. В этом случае заменяют реагенты и повторяют определение.

Среднее значение оптической плотности нулевого стандарта

Относительное поглощение или процент поглощения вычисляют по формуле

По величинам относительного поглощения, вычисленным для стандартных растворов, и соответствующим известным значениям концентрации ХАФ в нанограммах на килограмм строят градуировочную кривую в полулогарифмической системе координат.

Массовую долю ХАФ в анализируемой пробе меда в нанограммах на килограмм определяют по градуировочной кривой в соответствии с относительным поглощением, измеренным и вычисленным для каждого раствора.

Для определения массовой доли ХАФ в анализируемой пробе меда в микрограммах на килограмм величину концентрации ХАФ, полученную по градуировочной кривой, умножают на 1 (коэффициент разбавления при выполнении анализа в точном соответствии с приведенной методикой) и делят на тысячу (для перевода в микрограммы на килограмм).

Вычисления проводят с записью результата до второго десятичного знака.

Окончательный результат записывают с точностью до первого десятичного знака.

За окончательный результат определения принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости

где Мхдф f и Мхдф 2 — значения результатов параллельных определений остаточных количеств хпо-рамфеникола;

г— предел повторяемости для двух результатов параллельных определений при доверительной вероятности Р = 0,95 (таблица 5); ог— показатель повторяемости (относительное среднеквадратическое отклонение повторяе-_ мости) при доверительной вероятности Р — 0,95;

Мхаф — среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений остаточных количеств хпорамфеникола.

Статистический анализ результатов испытаний по оценке точности метода проводят в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 5725-6. Диапазон измерений массовой доли левомицетина (хло-рамфеникола), для которого рассчитаны метрологические характеристики, составляет 0,075—0,750 мкг/кг.

Абсолютное расхождение между результатами двух определений МхАф 1 и МхАф 2, которые получены в условиях повторяемости (одна и та же методика, идентичный объект испытания, одна и та же лаборатория, один и тот же оператор, одно и то же оборудование, короткий промежуток времени), не должно превышать предела повторяемости г= 2,8 стг -0,01 • МХАФ. Значения г и ог представлены в таблицах 4 и 5.

Таблица 4 — Значения характеристик погрешности и ее составляющих при доверительной вероятности Р = 0,95

Показатель повторяемости (относительное среднеквадратическое отклонение повторяемости) ст„ %

Показатель воспроизводимости (относительное среднеквадратическое отклонение воспроизводимости) aR, %

Показатель точности (границы относительной погрешности) + 5, %

Таблица 5 — Значения пределов повторяемости и воспроизводимости при доверительной вероятности Р = 0,95

Предел повторяемости (для двух результатов параллельных определений) г, % отн.

Предел воспроизводимости (значение допускаемого расхождения между двумя результатами измерений, полученными в разных лабораториях) R, % отн.

Абсолютное расхождение между результатами двух независимых измерений Мхдф 1 и Л4ХДФ 2, которые получены в условиях воспроизводимости (одна и та же методика, идентичный объект испытания, разные лаборатории, разные операторы, различное оборудование), не должно превышать предела воспроизводимости

1^хаф,1 ^ХАФ.г! — ^ 2,8 ‘Од ‘0,01 • Л4ХАФ, (7)

где aR— показатель воспроизводимости (относительное среднеквадратическое отклонение воспроиз-_ водимости) при доверительной вероятности Р = 0,95;

Мхаф — среднеарифметическое значение результатов определений остаточных количеств хлорамфе-никола, полученных в условиях воспроизводимости.

Значения Rhor представлены в таблицах 4 и 5.

7.6.3 При соблюдении всех регламентируемых методикой условий с доверительной вероятностью Р = 0,95 не должны превышать значений, приведенных в таблицах 4 и 5.

Результат измерения в документах, предусматривающих его использование, представляют в виде

где Мср — среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений остаточных количеств ХАФ, полученных в условиях повторяемости;

+ А — границы характеристик абсолютной погрешности результатов определения массовой доли ХАФ, мкг/кг;

+ А = +5 /Иср/100, значение относительной погрешности +5 представлено в таблице 4.

УДК 638.16:006.354 ОКС 67.180.10 С52 ОКСТУ 9101

Ключевые слова: натуральный мед, твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), антибиотики тетрациклиновой группы, левомицетин (хлорамфеникол), точность метода

Редактор М.Е. Никулина Технический редактор В.Н. Прусакова Корректор Р.А. Ментова Компьютерная верстка В.И. Гоищенко

Сдано в набор 03.09.2012. Подписано в печать 27.09.2012. Формат 60x84V8. Гарнитура Ариал. Уел. печ. л. 1,86.

Уч.-изд. л. 1,55. Тираж 221 экз. Зак. 847.

ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ», 123995 Москва, Гранатный пер., 4. www.gostinfo.ru info@gostinfo.ru Набрано во ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ» на ПЭВМ.

Отпечатано в филиале ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ» — тип. «Московский печатник», 105062 Москва, Лялин пер., 6.

Natural honey. Method for determination of antibiotics

Настоящий стандарт распространяется на натуральный мед и устанавливает метод определения остаточных количеств антибиотиков тетрацикпиновой группы и левомицетина (хлорамфеникола) (далее — ХАФ) на основе твердофазного иммуноферментного анализа (далее — ИФА).

Пределы обнаружения составляют:

— для тетрациклина, ролитетрациклина — 6 мкг/кг,

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р 12.1.019-2009 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения

ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике

ГОСТ Р 51568-99 (ИСО 3310-1—90) Сита лабораторные из металлической проволочной сетки. Технические условия

ГОСТ Р 52501-2005 (ИСО 3696:1987) Вода для лабораторного анализа. Технические условия ГОСТ Р 53228-2008 Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042—83, ИСО 4788—80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3145-84 Часы механические с сигнальным устройством. Общие технические условия

ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия

ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 14919-83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 19792-2001 Мед натуральный. Технические условия

ГОСТ 19881-74 Анализаторы потенциометрические для контроля pH молока и молочных продуктов. Общие технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

В настоящем стандарте применены термины по ГОСТ 19792, ГОСТ Р ИСО 5725-1, а также следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 антибиотики: Широкий спектр антимикробных ветеринарных препаратов (в т. ч. тетрацикли-ны, левомицетин), используемых для профилактики и лечения инфекционных заболеваний пчел.

3.2 остаточное количество антибиотика в меде: Массовая доля остатка антибиотика в меде, выражают в микрограммах на килограмм.

3.3 иммуноферментный анализ; ИФА (enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA): Лабораторный иммунологический метод качественного определения и количественного измерения антигенов и антител.

4.1 Требования электробезопасности при работе с приборами — по ГОСТ Р 12.1.019.

4.2 Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.

4.3 При выполнении анализов необходимо соблюдать требования безопасности при работе с химическими реактивами согласно ГОСТ 12.1.007.

5.2 Закристаллизованный мед размягчают на водяной бане, предназначенной для равномерного обогрева с помощью трубчатых электрических нагревательных элементов мощностью не более 1000 Вт, напряжение сети 220 В, диапазон регулировки температуры от 20 °С до 100 °С или в сушильном шкафу по ГОСТ 14919 при температуре не выше 40 °С и продавливают металлическим или пластмассовым шпателем с длиной рабочей поверхности не менее 20 мм через сито по ГОСТ Р 51568. Крупные механические частицы удаляют вручную.

5.3 Сотовый мед распечатывают, отделяют от сот с помощью металлического сита без нагревания.

Базовым принципом для количественного определения антибиотиков тетрациклиновой группы в меде является твердофазный конкурентный ИФА на планшетах из полистирола. Метод основан на конкуренции свободного антибиотика из меда и антибиотика, предварительно адсорбированного на твердой фазе (лунке планшета) в составе белкового конъюгата, за центры связывания специфичных к

тетрациклинам антител во вносимом растворе. После отделения несвязавшихся реагентов количество антител, прореагировавших с иммобилизованным антигеном, определяют с помощью вторичных анти-видовых антител, меченных пероксидазой хрена. Количество связавшегося с антителами конъюгата вторичных антител определяют с помощью субстрат-хромогенной смеси. Количество определяемого антибиотика, содержащегося в анализируемой пробе, обратно пропорционально регистрируемой оптической плотности продукта ферментативной реакции.

6.2.1 Фотометр микропланшетный вертикального сканирования с фильтрами, соответствующими длине волны 450 нм.

6.2.2 Дозаторы пипеточные автоматические с переменным объемом дозирования 0,010—0,100 см 1 2 3 ; 0,100—1,000 см 3 и 1,000—5,000 см 3 одноканальные.

6.2.3 Дозаторы пипеточные автоматические восьмиканальные с переменным объемом дозирования 0,050—0,300 см 3 .

6.2.4 Наконечники для автоматических пипеток вместимостью от 0,300 до 1,000 и до 5,000 см 3 однократного применения.

6.2.5 Анализатор потенциометрический с пределом допускаемой основной погрешности измерений + 0,01 ед. pH по ГОСТ 19881.

6.2.6 Весы по ГОСТ Р 53228, с пределами допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более + 0,1 мг и не более + 0,002 г.

6.2.7 Шейкер лабораторный для пробирок.

6.2.8 Часы механические с сигнальным устройством по ГОСТ 3145.

6.2.9 Центрифуга настольная с эффективностью не менее 3000 g или иного типа с теми же характеристиками.

6.2.10 Ультразвуковая ванна с эффективной мощностью ультразвука 60 Вт.

6.2.11 Аппарат универсальный для встряхивания.

6.2.12 Стаканы химические вместимостью 50, 100 см 3 по ГОСТ 25336.

6.2.13 Колбы мерные вместимостью 1000 см 3 по ГОСТ 1770.

6.2.14 Цилиндры мерные 2-25-1 поГОСТ 1770.

6.2.15 Набор реагентов для количественного определения тетрациклина типа «Ридаскрин Тетрациклин».

6.2.16 Натрий фосфорнокислый 2-замещенный 2-водный, с массовой долей основного вещества не менее 98 %.

6.2.17 Натрий фосфорнокислый 1-замещенный 1-водный, с массовой долей основного вещества не менее 98 %.

6.2.19 Натрия гидроокись по ГОСТ 4328.

6.2.20 Вода для лабораторного анализа категории 1 по ГОСТ Р 52501.

6.2.22 Стеклянные виалы вместимостью 1,5, 80 см 3 с завинчивающимися крышками.

6.2.23 Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.

6.2.24 Термостат или другое устройство, позволяющее производить равномерный нагрев до температуры 40 °С.

Для иммуноферментного определения тетрациклинов применяют промышленно изготовленные наборы, характеристики которых должны быть не ниже указанных в 6.3.1.

6.3.1.1 Планшет микротитровальный на 96 лунок (12 стрипов по 8 лунок), сенсибилизированных препаратом тетрациклина, — 1 шт.

6.3.1.2 Комплект стандартных растворов тетрациклина со следующими массовыми концентрациями 0; 1,5; 4,5; 13,5; 40,5; 121,5 нг/см 3 в водном растворе по 1,3 см 3 — 6 флаконов.

6.3.1.3 Раствор антител — 6,0 см 3 .

6.3.1.4 Конъюгат вторичных антител с пироксидазой — 10,0 см 3 .

6.3.1.5 Субстрат/хромоген, содержащий пероксид карбамида (мочевины) и тетраметилбензи-дин, —10,0 см 3 .

6.3.1.6 Стоп-реагент, содержащий 1 Н серную кислоту, — 14,0 см 3 .

6.3.1.7 Буфер 1 для разбавления стандартных растворов тетрациклина и растворов образцов — 50,0 см 3 .

6.3.1.8 Смесь солей для приготовления 1 дм 3 моющего буфера.

Примечание — Набор рассчитан на проведение 48 определений в двух повторностях, включая анализируемые пробы и калибровочные растворы (всего 96 определений на один планшет).

6.3.2.1 Специфичность метода

Метод анализа при использовании набора характеризуется показателем специфичности, составляющим для:

тетрациклина — 100 %; ролитетрацикпина — 100 %; хлортетрацикпина — 42 %; демекпоцикпина — 27 %; окситетрацикпина — 13 %; доксициклина — 8 %.

6.3.2.2 Чувствительность метода Пределы обнаружения:

— тетрациклина, ролитетрацикпина — 6 мкг/кг;

— хлортетрацикпина — 15 мкг/кг;

— окситетрацикпина — 50 мкг/кг;

Показатель извлекаемости тетрациклина из меда — (107 + 11) %.

6.3.3.1 При проведении испытаний следует использовать реагенты и компоненты, входящие в один и тот же набор. Разбавление или замена реагентов, использование реагентов из набора с другим номером партии могут привести к потере чувствительности или ошибке определения.

6.3.3.2 Необходимо хранить наборы при температуре 2 °С—8 °С.

Не допускается хранение при отрицательной температуре и замораживание реагентов набора. Для хранения неиспользованных стрипов (лунок) их герметично упаковывают в оригинальный фольги-рованный пакет вместе с имеющимся осушителем.

6.3.3.3 Необходимо избегать попадания прямых солнечных лучей на флакон с раствором хромогена из-за его светочувствительности.

6.3.3.4 Раствор хромогена подкрашен в розовый цвет для удобства использования. В случае окрашивания раствора хромогена в голубой цвет его применение для анализа не допускается, поскольку такое окрашивание раствора хромогена является признаком порчи.

6.3.3.5 Сроки хранения отдельных компонентов набора указаны на упаковке.

6.3.4.1 Стандартные растворы содержат тетрациклин, поэтому требуется особая осторожность.

6.3.4.2 Стоп-реагент содержит серную кислоту, поэтому следует избегать контакта стоп-реагента с кожей.

6.4.1 Отбор и подготовка проб меда — по разделу 5.

(4,00 + 0,01) г натрия гидроокиси по 6.2.19 взвешивают в стакане вместимостью 100 см 3 по 6.2.12, растворяют в 75 см 3 воды для лабораторного анализа по 6.2.20, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см 3 по 6.2.13, доводят до метки водой и тщательно перемешивают.

6.4.3 Приготовление фосфатного буфера 1 молярной концентрацией 20 ммоль/дм 3 для разбавления стандартных растворов тетрациклина и растворов образцов

(0,55 + 0,01) г натрия фосфорнокислого 1-замещенного 1-водного по 6.2.17 взвешивают в стакане вместимостью 50 см 3 по 6.2.12, растворяют в 25 см 3 воды для лабораторного анализа, количественно 4

переносят в мерную колбу вместимостью 10ОО см 3 . Аналогично взвешивают и растворяют (2,85 ± 0,01) г натрия фосфорнокислого 2-замещенного 2-водного по 6.2.16 и (9,00 + 0,01) г натрия хлористого по 6.2.18, оба раствора количественно переносят в ту же мерную колбу. В ту же колбу добавляют 800 см 3 воды для лабораторного анализа. Раствор тщательно перемешивают. Измеряют значение pH приготовленного раствора, которое должно составлять 7,4 ед. pH. В случае несоответствия значения pH довести его до требуемой величины добавлением в мерную колбу 0,1 Н раствора гидроокиси натрия по 6.4.2. Раствор доводят до метки водой и тщательно перемешивают.

Срок хранения буферного раствора при температуре 6 °С—10 °С — не более одного года.

Фосфатный буферный раствор готовят по 6.4.3. Количественно переносят 500 см 3 в мерную колбу вместимостью 1000 см 3 . Дополнительно в мерную колбу добавляют 0,5 см 3 твина 20 по 6.2.21, доводят водой до метки и тщательно перемешивают.

Срок хранения раствора при температуре 6 °С—10 °С — не более одного года.

Взвешивают (1,00 + 0,001) г меда, подготовленного по разделу 5, в стеклянной виале вместимостью 80 см 3 . Добавляют (49,00 + 0,001) г фосфатного буфера 1 по 6.4.3 и тщательно завинчивают крышку виалы. Виалу помещают в ультразвуковую ванну по 6.2.10 на 5 мин. Затем раствор интенсивно перемешивают на шейкере по 6.2.7 в течение 2 мин. Перед анализом встряхивают пробы вверх-вниз.

Перед использованием набора довести температуру всех реагентов до комнатной в пределах 20 °С—25 °С, а после использования охладить все оставшиеся реагенты до температуры 2 °—8 °С в холодильных приборах по ГОСТ 16317.

В процессе выполнения анализа нельзя допускать высыхания лунок планшета. На всех стадиях определения необходимо избегать воздействия прямого солнечного света.

Растворы антител, конъюгата, субстрата/хромогена, стоп-реагента, входящие в состав набора, поставляются в готовом к употреблению виде. Перед употреблением достаточно вскрыть флакон.

Подготовку стандартных растворов проводят только в одноразовых стеклянных виалах вместимостью 1,5 см 3 .

Для подготовки к использованию стандартных растворов тетрациклина концентраты стандартных растворов, входящих в состав набора, разбавляют буфером 1 (таблица 1). После разбавления необходимо тщательно перемешать готовые растворы.

После каждой серии определений необходимо готовить свежие стандартные растворы.

Построение градуировочной кривой необходимо проводить для каждой серии определений.

Таблица 1 — Приготовление стандартных растворов тетрациклина

Номер концентрата стандарта

Массовая концентрация разбавленного стандарта, мкг/дм 3

источник