Определение левомицетина в твороге

Левомицетин (хлорамфеникол, хлоромицетин) – это антибиотик широкого спектра действия. Он обладает бактериостатическим действием и эффективен против возбудителей таких заболеваний, как дизентерия, брюшной тиф, пневмония, газовая гангрена, сибирская язва бактерий рода Yersinia (возбудители иерсиниоза, псевдотуберкулеза и чумы) и многих других опасных микроорганизмов. Хлорамфеникол очень хорошо растворяется в жирах и в значительных количествах выделяется с молоком. Его молекула имеет небольшие размеры, и это, вместе с жирорастворимостью, позволяет ему легко проникать во все ткани тела, в том числе, в мозг.

ВОЗ рекомендует использовать масляную суспензию хлорамфеникола в качестве первой линии терапии менингита в странах с низким уровнем дохода. В форме мазей для наружного использования он применяется при фурункулезе и других кожных заболеваниях, а также при ранениях. Многие лечат с помощью левомицетина пищевые токсикоинфекции («пищевые отравления»). Согласно источникам, хлорамфеникол проявляет активность в отношении некоторых крупных вирусов. При этом микроорганизмы очень медленно вырабатывают резистентность к нему, потому левомицетин остается очень эффективным антибиотиком.

В сельском хозяйстве и ветеринарии левомицетин применяется для лечения животных и птицы, больных желудочно-кишечными заболеваниями, в том числе, кокцидиозом, который вызывают паразиты. Также его используют для лечения заболеваний дыхательных путей.

Впервые хлорамфеникол выделили в 1947 году из культуры почвенного микроорганизма Streptomyces venezuelae. В клинической практике он используется с 1949 года. Позднее левомицетин научились синтезировать искусственным путем, и в настоящее время его получают именно таким способом.

В России хлорамфеникол входит в список жизненно необходимых и важнейших лекарственных препаратов и применяется в животноводстве и ветеринарии. В США левомицетин не выпускается для перорального употребления с 1991 года. В странах Евросоюза использование этого средства в животноводстве запрещено. Рекомендации применять хлорамфеникол только для лечения тяжелых заболеваний, запреты на его использование в животноводстве или необходимость контролировать содержание левомицетина в пищевых продуктах связаны с побочными эффектами этого средства, возникающими при хроническом воздействии на человека. Одним из таких эффектов являются реакции гиперчувствительности вплоть до анафилактического шока. Но чаще они выражаются в крапивнице и других кожных проявлениях, особенно при использовании мазей с левомицетином.

Левомицетин метаболизируется в печени с образованием глюкоронида хлорамфеникола – неактивного соединения. В этом виде он выводится почками. Хлорамфеникол ингибирует активность одного из ферментов печени, участвующего в обмене стероидов и некоторых других соединений, а также в нейтрализации токсичных веществ, что нарушает работу печени. В некоторых случаях левомицетин вызывать почечные кровотечения. Хлорамфеникол долгое время остается в организме животных и в пищевых продуктах, в том числе, в мясе и молоке.

Длительное употребление левомицетина в высоких дозировках может вызывать желудочно-кишечные расстройства, раздражение слизистых оболочек рта и желудочно-кишечного тракта, а также возникновение язв на них. Кроме того, он подавляет микрофлору кишечника, что часто приводит к расстройствам пищеварения или вторичной грибковой инфекции.

Самые опасные эффекты хронического употребления левомицетина связаны с его воздействием на кроветворную систему. Он вызывает апластическую анемию (атрофию кроветворения): неизлечимое заболевание, вызванное повреждением клеток костного мозга. При ней снижается количество всех трех типов клеток крови: лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов. Это редкое осложнение, и при употреблении левомицетина оно чаще всего возникает, если это средство применяли перорально. К другим осложнениям со стороны кроветворной системы относится подавление работы костного мозга, а также лейкемия («рак крови»). Чаще всего такая реакция возникает у детей, причем риск ее возникновения увеличивается с увеличением длительности употребления левомицетина.

Дозы левомицетина, способные вызывать побочные эффекты, в том числе, апластическую анемию, до сих пор не определены. Поэтому в странах Евросоюза использование левомицетина при производстве пищевых продуктов животного происхождения запрещено. Минимальный предел чувствительности методов анализа, с помощью которых в Евросоюзе допускается проводить определение левомицетина (хлорамфеникола) в пище составляет 0,3 мкг/кг.

Согласно гигиеническим требованиям к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, принятым в Российской Федерации и странах Таможенного Союза, в соответствии с Техническим Регламентом Таможенного Союза ТР ТС 021/2011 («О безопасности пищевой продукции») содержание левомицетина (хлорамфеникола) в яйцах, мясе и других продуктов не допускается (должно быть менее 0,01 мг/кг, или 10 мкг/кг). Такие же нормы установлены для молочных продуктов Техническим Регламентом Таможенного Союза ТР ТС 033/2013 «О безопасности молока и молочной продукции». С 1 июля 2015 года, согласно ТР ТС 033/2013, максимально допустимое содержание левомицетина в молоке не должно превышать 0,0003 мг/кг (0,3 мкг/кг), что соответствует также нормам Евросоюза. С актуальными законодательными нормативами можно ознакомиться на сайте compact24.com.

Остаточные количества левомицетина (хлорамфеникола) в пищевых продуктах можно определять методами радиоиммуного анализа и жидкостной хроматографии высокого давления. Однако данные методы реализуются на дорогостоящем оборудовании и занимают длительное время. Кроме того, радиоиммунный метод анализа предполагает использование радиоактивных материалов, а хроматографические методы требуют квалифицированного обслуживания и трудоемки. Микробиологические методы определения антибиотиков, в том числе, левомицетина, просты и дешевы, но недостаточно специфичны, поскольку многие микроорганизмы чувствительны к различным антибиотикам.

Для скрининга и в рутинной лабораторной практике широко применяют иммуноферментный метод анализа. Например, с сентября 1998 г. в Германии ИФА является официальным методом скрининга остатков левомицетина в молоке; см.§ 35 LMBG, 01.00 68. В Белоруссии утверждены МУК 10-1-5/118/В от 18.08.2003 по контролю левомицетина в молоке, сухом молоке, яйцах и мясе с помощью тест-системы RIDASCREEN® Chloramphenicol. В России метод иммуноферментного анализа для определения левомицетина в пищевых продуктах утвержден МУК 4.1.1912-04.

источник

Владельцы патента RU 2431829:

Группа изобретений относится к концентрированию и определению антибиотика левомицетина в пищевых продуктах методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Сущность изобретения: левомицетин экстрагируют из пробы ацетонитрилом, отделяют на центрифуге раствор, в котором находится антибиотик, к центрифугату добавляют сорбент — вермикулит при массовом соотношении вермикулита, равном 0,1 г сорбента на 1 г жира в пробе, и встряхивают в течение 30 минут, затем раствор отделяют и пропускают через смесь сорбентов — активированного угля и вермикулита, взятых в массовом соотношении, равном 1:1, и промывают дистиллированной водой, элюируют левомицетин этанолом, элюат упаривают досуха на водяной бане и охлаждают до комнатной температуры, затем остаток растворяют в подвижной фазе (ацетонитрил:вода, 70:30 об./об.), раствор левомицетина переносят дозатором в сухие виалы и количественно определяют левомицетин методом ОФ ВЭЖХ с УФ-детектированием при длине волны 278 нм; содержание антибиотика рассчитывают при помощи градуировочного графика. Достигается повышение точности и безопасности анализа. 2 н.п. ф-лы, 1 табл., 4 ил.

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам определения антибиотика левомицетина в пищевых продуктах методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Антибиотики, в частности левомицетин (хлорамфеникол), используют в качестве эффективных противоинфекционных средств в ветеринарии и при профилактике заболеваний домашней птицы и скота. При этом антибиотик способен переходить в мясо, молоко животных, яйца птиц и другие пищевые продукты. Так как в последние годы в мире наблюдается устойчивая тенденция ужесточения требований к качеству пищевых продуктов, необходима разработка и введение в практику новых, более эффективных и чувствительных методов анализа.

Существуют различные методы определения левомицетина в пищевых продуктах (иммуноферментный анализ, химические методы (качественные реакции на данный антибиотик с различными специально подобранными реагентами), физико-химические методы (вольтамперометрия, полярография, спектрофотометрия), тонкослойная хроматография, газовая хроматография). При использовании данных методов анализа часто сталкиваются с определенными трудностями, например необходимостью использования специфических, редких и достаточно дорогостоящих реактивов; невозможностью определения сразу нескольких препаратов при совместном присутствии и неудовлетворительным нижним пределом обнаружения антибиотика; необходимостью использования предколонки (для газовой хроматографии).

Одним из наиболее перспективных методов определения антибиотика левомицетина является метод обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ), который дает возможность извлекать, разделять, идентифицировать и количественно определять лекарственные препараты в биологических жидкостях.

Известен способ количественного определения левомицетина в пищевых продуктах измерением массовой доли антибиотика методом ОФ ВЭЖХ с фотометрическим детектированием с использованием жидкостного хроматографа «Люмахром» [1]. Способ состоит в экстракции левомицетина из образца дистиллированной водой, дальнейшей очистке экстракта при помощи концентрирующего патрона ДИАПАК-C₁₆ и в определении левомицетина методом ОФ ВЭЖХ с использованием фотометрического детектора (254 нм). Патроны ДИАПАК-С₁₆ представляют собой корпусы из химически устойчивого полимера, заполненные высококачественными химически модифицированными сорбентами на основе силикагеля с привитыми гексадецильными группами. Способ имеет ряд недостатков: левомицетин из проб экстрагируется водой, что затрудняет дальнейший анализ, т.к. экстракты получаются достаточно загрязненными посторонними, мешающими определению антибиотика веществами; способ предполагает использование летучих и токсичных растворителей — хлороформа и гексана; определение левомицетина методом ОФ ВЭЖХ с ультрафиолетовым детектором проводят при длине волны 254 нм. Однако в этой области спектра интенсивное поглощение характерно для практически всех веществ, содержащих ароматический цикл; следовательно, известный метод определения левомицетина не гарантирует точных результатов.

Исследована возможность патронов ДИАПАК-C₁₆ для концентрирования антибиотиков цефазолина и левомицетина из разбавленных растворов с последующим их определением методом ОФ-ВЭЖХ [2]. Сорбцию препаратов проводят в статическом и динамическом режимах, антибиотики десорбируют ацетонитрилом, полученные растворы анализируют методом ОФ ВЭЖХ с использованием подвижной фазы (ацетонитрил-вода, 50:50 об./об.); колонки Zorbax ODS C₁₈ (15×0,46 см), рабочие длины волн — 210 и 254 нм. Однако данная методика позволяет осуществлять выделение и анализ антибиотиков из разбавленных водных растворов фармацевтических препаратов и не адаптирована для анализа пищевых продуктов с высоким содержанием жира.

Известен способ определения левомицетина в мясе краба и в креветках с помощью ВЭЖХ с масс-детектированием [3]. Антибиотик экстрагируют этилацетатом, в качестве подвижной фазы используют метанол. Недостатками данного способа являются: применение высокотоксичного метанола в качестве подвижной фазы; использование дорогостоящего и сложного в освоении жидкостного хроматографа с масс-детектором, что затрудняет широкое применение известного способа анализа.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к способу определения левомицетина в пищевых продуктах является способ извлечения антибиотиков из пищевой продукции органическими растворителями — метанолом и ацетонитрилом с последующей очисткой экстракта растворами Карреза (водный раствор Zn(СН₃СОО)₂ и K₄[Fe(CN)₆]×3H₂O), после чего экстракт обрабатывают диэтиловым эфиром для удаления липидов и анализируют методом ОФ ВЭЖХ с использованием подвижной фазы (ацетонитрил:вода, 70:30 об./об.) (колонка Zorbax ODS C₁₈ (15×0,46 см), с УФ-детектированием при 220, 254 и 273 нм) [4]. Количество антибиотика в пробе определяют с помощью градуировочного графика. Предел обнаружения антибиотика левомицетина в способе-прототипе составляет 0,9±0,2 нг в одной порции раствора, вводимой в хроматограф для анализа. Недостатками данного способа являются необходимость применения высокотоксичного реагента — метанола, а также недостаточная точность определения левомицетина вследствие частичного осаждения антибиотика на хлопьевидном осадке гексацианоферрата цинка.

Задачей заявляемого изобретения является разработка воспроизводимого, прецизионного способа выделения и концентрирования левомицетина из пищевых продуктов, а также его количественного определения.

Поставленная задача достигается тем, что левомицетин экстрагируют из пробы ацетонитрилом, отделяют на центрифуге раствор, в котором находится антибиотик, к центрифугату добавляют сорбент — вермикулит (массовое соотношение которого 0,1 г сорбента на 1 г жира в пробе) и встряхивают в течение 30 минут, затем раствор отделяют и пропускают через смесь сорбентов — активированного угля и вермикулита, взятых в массовом соотношении, равном 1:1, и промывают дистиллированной водой, элюируют левомицетин этанолом, элюат упаривают досуха на водяной бане и охлаждают до комнатной температуры, затем остаток растворяют в подвижной фазе (ацетонитрил:вода, 70:30 об./об.), раствор левомицетина переносят дозатором в сухие виалы и количественно определяют левомицетин методом ОФ ВЭЖХ с УФ-детектированием при длине волны 278 нм; содержание антибиотика рассчитывают при помощи градуировочного графика.

Поставленная задача наилучшим образом решается новыми, ранее не известными из уровня техники условиями пробоподготовки образца, а именно:

— последовательным применением сорбентов:

— вначале — вермикулита, массовое соотношение которого 0,1 г сорбента на 1 г жира в пробе;

— затем — смеси активированного угля и вермикулита при их массовом соотношении, равном 1:1;

— последующей переэкстракцией антибиотика этанолом.

В заявляемом способе используют вермикулит (природный цеолит) Кокшаровского месторождения Приморского края.

Указанные существенные отличительные признаки заявляемого изобретения обеспечивают концентрирование антибиотика, очистку экстракта от мешающих анализу компонентов, что особенно актуально при анализе пищевых продуктов с высоким (>30%) содержанием жира, и позволяют определить левомицетин известным ОФ ВЭЖХ-методом с достаточной степенью точности.

Техническим результатом предлагаемого способа определения содержания левомицетина в пищевых продуктах является повышение точности количественного определения антибиотика в пищевых продуктах с различным содержанием жира, а также снижение токсичности проведения аналитических исследований.

Способ определения содержания левомицетина в пищевых продуктах осуществляют следующим образом. Левомицетин экстрагируют из пробы ацетонитрилом и отделяют раствор, в котором находится антибиотик с примесями, от осадка (свернувшийся белок). В полученный раствор антибиотика в ацетонитриле добавляют вермикулит, массовое соотношение которого 0,1 г сорбента на 1 г жира в пробе, встряхивают колбу со смесью в течение 30 минут на встряхивателе и отделяют раствор от сорбента. Отфильтрованный раствор пропускают через смесь сорбентов (активированный уголь и вермикулит, взятых при массовом соотношении, равном 1:1), промывают дистиллированной водой и элюируют антибиотик этанолом. Элюат в круглодонных колбах упаривают досуха на водяной бане, охлаждают до комнатной температуры и растворяют в подвижной фазе (ацетонитрил:вода, 70:30 об./об.). Раствор левомицетина переносят дозатором в сухие виалы и количественно определяют антибиотик методом ОФ ВЭЖХ с УФ-детектированием при длине волны 278 нм; содержание антибиотика рассчитывают при помощи градуировочного графика.

Экспериментально установлена необходимость последовательного применения сорбентов: вначале — вермикулита для дополнительной очистки экстракта от примесей. Необходимость использования вермикулита при его массовом соотношении, равном 0,1 г сорбента на 1 г жира в пробе, подтверждена экспериментальным путем и обусловлена тем, что при статической сорбции из раствора на вермикулите происходит сорбция примесей (липиды, белки и др.), которые присутствуют в экстракте. Таким образом, достигается предварительная очистка экстракта от балластных веществ.

Для сорбции левомицетина из раствора после отделения вермикулита используется бинарный сорбент (активированный уголь и вермикулит при их массовом соотношении, равном 1:1), применение которого позволяет не только проводить доочистку экстракта от соэкстрагированных примесей, но и концентрировать левомицетин в количествах, необходимых для хроматографического анализа. Активированный уголь сорбирует примеси из раствора левомицетина в этаноле, обеспечивает получение прозрачного и пригодного для ОФ ВЭЖХ-анализа раствора левомицетина. Для того чтобы минимизировать возможность сорбции антибиотика на угле, необходимое количество активированного угля предварительно рассчитывают по формуле (1), если содержание жира в продукте ≥3,9%; и по формуле (2), если содержание жира в продукте меньше чем 3,9%:

m_R — масса остатка после экстракции ацетонитрилом;

f — содержание жира в исследуемом продукте.

где m_S2 — масса сорбента, необходимая для анализа пищевого продукта, с содержанием жира менее 3,9%,

f — содержание жира в исследуемом продукте.

После расчета навески активированного угля, необходимой для анализа продукта на левомицетин, готовят смесь сорбентов при их массовом соотношении, равном 1:1; такое соотношение сорбентов является оптимальным и установлено экспериментально.

Изменение соотношения активированный уголь:вермикулит приводит либо к уменьшению степени извлечения антибиотика, либо к получению мутных растворов, непригодных для анализа методом ОФ ВЭЖХ.

Элюирование левомицетина осуществляется этанолом, поскольку этот растворитель обладает достаточной полярностью для наиболее полного элюирования левомицетина с сорбента. Менее полярные растворители извлекают с сорбента и неполярные примеси, что приводит к уменьшению точности анализа антибиотика заявляемым способом. Не маловажным при выборе растворителя на стадии элюирования левомицетина является меньшая токсичность этанола по сравнению с метанолом, используемым в способе-прототипе.

Заявляемый способ впервые позволяет анализировать пищевые продукты с различным содержанием жира — от 1,0% до 60% с достаточно высокой степенью извлечения антибиотика, а именно (98,5-90)%, что подтверждается данными таблицы.

Правильность предлагаемого способа определения содержания левомицетина в пищевых продуктах подтверждена методом «введено-найдено» и экспериментальными данными (примеры 1-3); хроматограммы представлены на фигурах 1-4.

На фиг.1 представлена хроматограмма стандартного раствора левомицетина с концентрацией антибиотика 0,01 мг/мл, приготовленного из фармацевтического препарата «Хлорамфеникола натрия сукцинат», приобретенного в аптечной сети. Пик вещества со временем удерживания 2,492 мин принят за пик левомицетина.

На фиг.2 представлена хроматограмма раствора левомицетина с концентрацией 0,01 мг/мл, внесенного в пищевой продукт (растительный маргарин, жирностью 40%) и выделенного из него по заявляемому способу. Пик вещества со временем удерживания 2,429 мин принят за пик левомицетина.

На фиг.3 представлена хроматограмма раствора левомицетина, выделенного по заявляемому способу из пищевого продукта «яйцо куриное». Пик вещества со временем удерживания 2,418 мин принят за пик левомицетина.

На фиг.4 представлена хроматограмма раствора левомицетина с концентрацией 0,01 мг/мл, внесенного в пищевой продукт (растительный маргарин, жирностью 60%) и выделенного из него по заявляемому способу. Пик вещества со временем удерживания 2,437 мин принят за пик левомицетина.

Возможность осуществления заявляемого способа иллюстрируется примерами.

Пример 1. Определение левомицетина (хлорамфеникола) в яйцах куриных

В коническую колбу вместимостью 100,0 мл вносят 50 г куриных яиц, предварительно тщательно гомогенизированных в стеклянной посуде, приливают 100 мл ацетонитрила (хч) и ставят на встряхиватель на 2 часа. Полученный экстракт фильтруют через стекловату, помещенную в стеклянную воронку и промытую 5 мл ацетонитрила. В полученный раствор добавляют 1 г вермикулита. Колбу с экстрактом и сорбентом помещают на встряхиватель на 30 минут, фильтруют раствор и пропускают через бинарный сорбент — смесь 3,85 г активированного угля и 3,85 г вермикулита, после чего сорбенты промывают 10 мл дистиллированной воды. Затем левомицетин элюируют 10 мл этанола и упаривают раствор на водяной бане в круглодонной колбе досуха. Колбу охлаждают на воздухе до комнатной температуры и ополаскивают 1 мл подвижной фазы (ацетонитрил:вода, 70:30 об./об.). Раствор антибиотика в подвижной фазе собирают дозатором на 1000 мкл и переносят в сухую чистую виалу. Количество антибиотика находят методом ОФ ВЭЖХ (жидкостный хроматограф Shimadzu LC-6A с УФ-детектором, колонка Zorbax ODS C₁₈ (15×0,46 см), подвижная фаза (ацетонитрил:вода, 70:30 об./об.) при рабочей длине волны 278 нм. Содержание левомицетина (мг/кг), рассчитанное по методу градуировочного графика составило: 0,0140±0,0011 мг/кг; степень извлечения — 98,9% (фиг.3).

Пример 2. Определение левомицетина в маргарине с жирностью 40,0%

Определение антибиотика проводили по примеру 1, но перед экстракцией 50 г маргарина растопили в колбе при температуре 55°С (достаточная температура, чтобы растопить жир, содержащийся в маргарине, и не разрушить антибиотик), добавили 1 мл раствора левомицетина с концентрацией 0,1 мг/мл. Затем, не охлаждая образец, прибавили 100 мл ацетонитрила и проводили экстракцию левомицетина на встряхивателе в течение 3 часов при температуре 50°С. В полученный раствор добавили 1 г вермикулита. Колбу с экстрактом и сорбентом помещали на встряхиватель на 30 минут, отфильтровывали раствор и пропускали через бинарный сорбент — смесь 27,0 г активированного угля и 27,0 г вермикулита. Далее — по примеру 1. Содержание левомицетина составило 0,09105 мг/кг; степень извлечения — 91% (фиг.2).

Пример 3. Определение содержания левомицетина в маргарине жирностью 60,0% Количество внесенного антибиотика такое же, как в примере 2. Время экстракции ацетонитрилом — 4 часа. Бинарный сорбент — 40,5 г активированного угля и 45,5 г вермикулита. Содержание левомицетина составило 0,0891 мг/кг; степень извлечения — 89% (фиг.4).

Экспериментально установлено, что в зависимости от содержания жира в продукте время экстракции необходимо изменять. Для продуктов с содержанием жира от 1 до 10% оно составляет 2 часа, для продуктов с содержанием жира от 10 до 40% — 3 часа, выше 40% — 4 часа. Увеличение времени экстракции более 4 часов не приводит к увеличению степени извлечения антибиотика; при времени экстракции менее 2 часов экстракция левомицетина не является полной.

Заявляемый способ выделения, концентрирования и идентификации антибиотика левомицетина (хлорамфеникола) прост, не трудоемок, не требует большого количества реактивов и может быть применен в любой химической лаборатории, где имеется жидкостный хроматограф с УФ-детектором. Погрешность измерения составляет 3-4% для концентрации до 0,01 мг/кг и 10% для больших концентраций.

1. № М 01-28-2002. «Методика выполнения измерений массовой доли левомицетина (хлорамфеникола) в продуктах животного происхождения методом ОФ ВЭЖХ с фотометрическим детектированием с использованием жидкостного хроматографа «Люмахром»». — г.Санкт-Петербург: ООО «Люмэкс», 2008.

2. Концентрирование антибиотиков цефазолина, цефотаксима и левомицетина на модифицированных кремнеземах. / Л.И.Соколова, И.В.Чучалина. // Журнал аналитической химии. — 2006. — Т.61, №12, с.1238-1242.

3. Rupp. H.S. Liquid chromatography/tandem mass spectrometry analysis of chloramphenicol in cooked crabmeat / H.S.Rupp, J.S.Stuart, J.A.Hurlbut // Journal of AOAC International. — 2005. — Vol.88, N 4. — PP.1155-1159.

4. Определение бензилпенициллина, левомицетина и тетрациклина в пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. / Л.И.Соколова, А.П.Черняев. // Журнал аналитической химии. — 2001. — Т.56, №11, с.1177-1180.

1. Способ определения содержания левомицетина в пищевых продуктах, включающий экстракцию левомицетина из пробы ацетонитрилом, отделение от осадка раствора, содержащего левомицетин, очистку раствора сорбентом-вермикулитом при массовом соотношении 0,1 г сорбента на 1 г жира в пробе, доочистку раствора и концентрирование из него левомицетина при пропускании через сорбент в виде смеси активированного угля и вермикулита при их массовом соотношении 1:1, десорбцию левомицетина при элюировании этанолом, упаривание элюата с последующим растворением охлажденного остатка в подвижной фазе ацетонитрил-вода при их объемном соотношении 70:30, анализ полученного раствора методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии и расчет содержания левомицетина при помощи градуировочного графика.

2. Сорбент для осуществления способа по п.1, содержащий активированный уголь и вермикулит при их массовом соотношении, равном 1:1.

источник

ГОСТ 33526-2015 Молоко и продукты переработки молока. Методика определения содержания антибиотиков методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Текст ГОСТ 33526-2015 Молоко и продукты переработки молока. Методика определения содержания антибиотиков методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0—92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2—2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены»

1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным научным учреждением «Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности»

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстандарт)

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны

Сокращенное наименование национального

Минэкономики Республики Армения

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 30 ноября 2015 г. N9 2085-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 33526—2015 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2016 г.

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — е ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано е ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии е сети Интернет

В Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

МОЛОКО И ПРОДУКТЫ ПЕРЕРАБОТКИ МОЛОКА

Методика определения содержания антибиотиков методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Method tor determination ol the antibiotic by high performance liquid chromatography

Настоящий стандарт распространяется на молоко и продукты переработки молока (молоко (сырое. питьевое), сливки (сырые, питьевые), молочные продукты, молокосодержащие продукты, побочные продукты переработки молока, продукцию детского питания на молочной основе, сыр и сырные продукты, масло из коровьего молока и масляную пасту, консервы молочные, мороженое и смеси для мороженого и устанавливает метод высокоэффективной жидкостной хроматографии по определению остаточного содержания антибиотиков: левомицетина (хлорамфеникола), пенициллиновой группы, стрептомицина, тетрациклиновой группы.

Диапазон измерений массовых долей антибиотиков для левомицетина (хлорамфеникола) от 0.0001 млн 1 (мг/кг) до 1.0 млн 1 (мг/кг). для антибиотиков пенициллиновой и тетрациклиновой групп от 0.001 млн 1 (мг/кг) до 1.0 млн 1 (мг/кг). для стрептомицина от 0,005 млн 1 (мг/кг) до 1.0 млн 1 (мг/кг).

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ ИСО 5725-1—2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения 1

ГОСТ ИСО 5725-6—2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике 2

ГОСТ CiML R 76-1—2011 Государственная система обеспечения единства измерений. 8есы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 12.1.004—91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005—88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007—76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019—79 Система стандартов безопасности труда. Электробеэоласностъ. Общие требования и номенклатура видов защиты 3

ГОСТ 12.4.009—83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 12.4.021—75 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования

ГОСТ 245—76 Реактивы. Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-еодный. Технические условия

ГОСТ 908—2004 Кислота лимонная моногидрат пищевая. Технические условия

ГОСТ 1770—74 (ИСО 1042—83. ИСО 4786—80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры. мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

‘ На территорш Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-1—2002. 3 На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-6—2002. 9 На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 12.1.019—2009.

ГОСТ 2603—79 Реактивы. Ацетон. Технические условия ГОСТ 5848—73 Реактивы. Кислота муравьиная. Технические условия ГОСТ 6552—80 Реактивы. Кислота ортофосфорная. Технические условия ГОСТ 6709—72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9147—80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия ГОСТ 10652—73 Реактивы. Соль динатриевая этилендиамик-Ы.Г^М’.М’-тетрауксусной кислоты. 2-еодная (трилон Б). Технические условия

ГОСТ 12026—76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия ГОСТ 25336—82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Тилы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26809.1—2014 Молоко и молочная продукция. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу. Часть 1. Молоко, молочные, молочные составные и молокосодержащие продукты

ГОСТ 26809.2—2014 Молоко и молочная продукция. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу. Часть 2. Масло из коровьего молока, спреды, сыры и сырные продукты, плавленые сыры и плавленые сырные продукты

ГОСТ 29227—91 (ИСО 835-1—81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов на территории государства по соответствующему указателю стандартов, составленному по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

Метод основан на экстракции антибиотиков из пробы продукта, очистке экстракта и определении антибиотиков в экстракте методом высокоэффективной жидкостной хроматографии со спектрофотометрическим детектированием.

4 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда и реактивы

Хроматограф для проведения ВЭЖХ. включающий следующие элементы:

— колонка хроматографическая обращенно-фазная (250 4.6) мм. заполненная силикагелем с диаметром частиц сорбента 3 мкм;

— детектор спектрофотометрический или диодно-матричный с длиной волны детектирования 265 нм и 280 нм с погрешностью задания длины волны 11 нм;

— петлевое устройство для ввода пробы с рабочим объемом петли 0.020 см э ;

— регистрирующее устройство, позволяющее проводить измерения площади (или высоты) пика с погрешностью ± 1 %;

— программное обеспечение для статистической обработки полученных результатов измерений. Устройство вакуумное для твердофазной экстракции.

Картридж для твердофазной экстракции объемом не более 6 см 3 , заполненный обращенно-фазным сорбентом с диаметром частиц не более 50 мкм.

Весы неавтоматического действия по ГОСТ OIML R 76-1 или весы по нормативным документам, действующим на территории государств, принявших стандарт, с пределом допускаемой абсолютной погрешности ± 0.5 мг и ± 1.0 мг.

Анализатор потенциометрический (pH-метр) с диапазоном измерения 1-14 ед. pH, с пределом допускаемой абсолютной погрешности ± 0.01 ед. pH.

Центрифуга лабораторная с охлаждением, обеспечивающая скорость вращения не менее 15000 об/мин и диапазон температур охлаждения от 4 в С до 20 в С. с адаптерами для пробирок вместимостью 15 см 3 и микроцентрифужных пробирок вместимостью 1.5 см 3 .

Модуль термостатируемый нагревательный с системой отдувки растворителей инертным газом и максимальной температурой термостатироаания 40 в С.

Баня водяная термостатируемая.

Баня ультразвуковая с рабочей частотой не менее 20 Гц и объемом не менее 1 дм 3 .

Гомогенизатор роторный с четырехлопастным ножом, с угловой скоростью вращения ножей (1000 — 10000) мин 1 . включающий емкость вместимостью 1.0 дм 3 .

Встряхиватель лабораторный (вортекс) вибрационный для пробирок орбитального типа движения с амплитудой вращения гнезда 3 мм и скоростью вращения гнезда (150 — 2500) мин \

Дозаторы механические переменного объема (0.1-3 мм 3 . 0,5-10 мм 3 . 20-200) мм 3 . 100-1000 мм 3 . 1-5 см 3 ) с наконечниками.

Колбы мерные 2-50-2,2-100-2. 2-1000-2 по ГОСТ 1770.

Пипетки М-1-5, 1-1-1-10 по ГОСТ 29227.

Пробирки мерные стеклянные П-1-10-0.1 ХС по ГОСТ 1770.

Цилиндр 1-25-1. 1-100-1. 1-250-2 лоГОСТ 1770.

Виалы (флаконы полипропиленовые) вместимостью 15 см 3 и 50 см 3 с герметично закрывающимися пластмассовыми крышками.

Колба Кн-1-250-24/29, Кн-1-500-24/29 ТС по ГОСТ 25336.

Стакан В-1-100. В-1-500. В-1-1000 ТС по ГОСТ 25336.

Воронка В-56 50 ХС по ГОСТ 25336.

Ступка фарфоровая с пестиком по ГОСТ 9147.

Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.

Фильтр нейлоновый с размером пор 0.45 мкм.

Бекзилпенициллин. массовой долей основного вещества не менее 99 %.

Демеклоциклин. массовой долей основного вещества не менее 90 %.

Доксициклин, массовой долей основного вещества не менее 90 %.

Кислота лимонная моногидрат пищевая по ГОСТ 908.

Кислота муравьиная по ГОСТ 5548. ч.д.а.

Кислота ортофосфорная по ГОСТ 6552. х.ч.

Метанол для хроматографии (метиловый спирт), х.ч.

Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-еодный по ГОСТ 245. ч.д.а.

Окситетрациклина гидрохлорид, массовой долей основного вещества не менее 90 %.

Соль динатриевая этилвндиамин-М.М.М.Ы’-тетраухсУсной кислоты 2-водная (трилон Б) по ГОСТ 10652. х.ч.

Стрептомицина сульфат, массовой долей основного вещества не менее 96 %.

Тетрациклина гидрохлорид, массовой долей основного вещества не менее 90 %. Хлорамфеникол (левомицетин), массовой долей основного вещества не менее 99 %. Хлортетрациклин гидрохлорид, массовой долей основного вещества не менее 90 %. Феноксиметилпенициллин. массовой долей основного вещества не менее 99 %.

Вода для лабораторного анализа деионизированная, с удельным сопротивлением 28 Ом. степень чистоты 2 по ISO 3696.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Допускается применение других средств измерения, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающим необходимую точность измерения, а также реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.

Отбор проб — по ГОСТ 26809.1, ГОСТ 26809.2, а также другим нормативным документам, действующим на территории государств, принявших стандарт.

Если определение не может быть проведено сразу после отбора проб, их хранят в холодильнике при температуре (4 ± 2) ®С не более 48 ч.

6 Подготовка к проведению измерений

6.1 Приготовление растворов

6.1.1 Приготовление раствора лимонной кислоты молярной концентрации с (С₆Н_в7 Н₂0)* 0,1 моль/дм 3

В мерную колбу вместимостью 1000 см 3 помещают (21,000 ± 0.001) г лимонной кислоты, растворяют в небольшом количестве деионизированной воды и тщательно перемешивают. Объем раствора доводят деионизированной водой до метки.

Раствор хранят при температуре (20 ± 2) *С не более 1 мес.

6.1.2 Приготовление раствора натрия фосфорнокислого молярной концентрации с (ЫаНгРО* 2НгО) * 0,2 моль/дм 3

В мерную колбу вместимостью 1000 см 3 вносят (35.600 ± 0.001) г натрия фосфорнокислого, растворяют в небольшом количестве деионизированной воды и тщательно перемешивают. Объем раствора доводят деионизированной водой до метки.

Раствор хранят при температуре (20 ± 2) *С не более 1 мес.

6.1.3 Приготовление буферного раствора

В конической колбе вместимостью 250 см 3 смешивают 60 см 3 раствора лимонной кислоты молярной концентрации 0.1 моль/дм 3 (6.1.1) и 40 см 3 раствора натрия фосфорнокислого молярной концентрации 0.2 моль/дм 3 (6.1.2). добавляют (37.200 ± 0,001) г трилона Б. аккуратно перемешивают и измеряют значение pH полученного раствора. Значение pH должно составлять 4,0. При необходимости значение pH доводят до 4.0 ед.рН ортофосфорной кислотой.

Раствор хранят при температуре (20 ± 2) *С не более 1 мес.

6.1.4 Приготовление растворов элюентов мобильной фазы А и Б

6.1.4.1 Для приготовления раствора элюента мобильной фазы А в мерную колбу вместимостью 1000 см 3 помещают 200 см 3 деионизированной воды, добавляют 5 см 3 муравьиной кислоты и тщательно перемешивают. Объем раствора доводят деионизированной водой до метки, фильтруют через нейлоновый фильтр.

Раствор хранят при температуре (2012) °С не более 1 мес.

6.1.4.2 Для приготовления раствора элюента мобильной фазы Б в мерную колбу вместимостью 1000 см 3 помещают 200 см 3 метанола, добавляют 5 см 3 муравьиной кислоты и тщательно перемешивают. Объем раствора доводят метанолом до метки, фильтруют через нейлоновый фильтр.

Раствор хранят при температуре (20 ± 2) *С не более 1 мес.

6.1.5 Приготовление 50 %-ного раствора метанола

В мерную колбу вместимостью 50 см 3 помещают 25,0 см 3 метанола, добавляют небольшое количество деионизированной воды и тщательно перемешивают. Объем раствора доводят деионизированной водой до метки. Колбу помещают на ультразвуковую баню на 5 мин.

Срок хранения раствора в темной посуде при температуре (4 ± 2) *С — не более 1 мес.

6.1.6 Приготовление градуировочных растворов

6.1.6.1 Приготовление основных градуировочных растворов

6.1.6.1.1 В мерную пробирку вместимостью 10 см 3 помещают по 10 мг доксициклина. окситетра-циклина гидрохлорида, тетрациклина гидрохлорида и хпортетрациклина гидрохлорида, взвешенных с точностью до 0.5 мг. Добавляют 5 см 3 метанола и помещают в ультразвуковую баню на 1 мин. Объем полученного раствора доводят метанолом до метки.

6.1.6.1.2 В мерную пробирку вместимостью 10 см 3 помещают 10 мг стрептомицина сульфата, взвешенного с точностью до 0,5 мг. Добавляют 5 см 3 метанола и помещают в ультразвуковую баню на 1 мин. Объем полученного раствора доводят метанолом до метки.

6.1.6.1.3 В мерную пробирку вместимостью 10 см 3 помещают 10 мг хлорамфеникола (левоми-цитина). взвешенного с точностью до 0.5 мг. Добавляют 5 см 3 метанола и помещают в ультразвуковую баню на 1 мин. Объем полученного раствора доводят метанолом до метки.

6.1.6.1.4 8 мерную пробирку вместимостью 10 см 3 помещают по 10 мг феноксиметилпекицил-лина. бензилпенициллина. взвешенных с точностью до 0.5 мг. Добавляют 5 см 3 метанола и помещают в ультразвуковую баню на 1 мин. Объем полученного раствора доводят метанолом до метки.

6.1.6.1.5 Массовая концентрация каждого антибиотика в растворах по 6.1.6.1.1 — 6.1.6.1.4 составляет 1 мг/см 3 (или 1000 мг/дм 3 ).

Уточненное значение концентрации антибиотика рассчитывается с учетом содержания основного вещества.

6.1.6.1.6 Раствор антибиотика массовой концентрации 0.1 мг/см 3 (или 100 мг/дм 3 ) готовят из раствора антибиотика массовой концентрации 1 мг/см 3 (6.1.6.1.5) путем его разведения метанолом в 10 раз.

Растворы хранят при температуре минус (20 ± 2) «С не более 3 мес.

Перед применением раствор выдерживают при комнатной температуре в темном месте не менее 20 мин. но не более 2 ч.

6.1.6.2 Приготовление градуировочных образцов

Для построения градуировочного графика готовят серию градуировочных образцов в количестве не менее пяти с массовыми концентрациями антибиотиков в диапазоне от 0.001 мг/дм 3 до 1 мг/дм 3 (для левомицетина в диапазоне от 0,00015 мг/дм 3 до 0,1 мг/дм 3 ) путем разбавления метанолом основных градуировочных растворов антибиотиков, приготовленных по 6.1.6.1.

6.1.6.3 Приготовление раствора внутреннего стандарта демеклоциклина

В мерную пробирку вместимостью 10 см 3 помещают 10 мг демеклоциклина. взвешенного с точностью до 0.5 мг. Добавляют 5 см 3 метанола и помещают в ультразвуковую баню на 1 мин. Объем полученного раствора доводят метанолом до метки.

Массовая концентрация раствора внутреннего стандарта демеклоциклина в растворе составляет 1 мг/см 3 (уточненное значение концентрации внутреннего стандарта рассчитывается с учетом содержания основного вещества).

Путем нескольких разбавлений доводят массовую концентрацию раствора внутреннего стандарта демеклоциклина до значения 1 мкг/см 3 . Раствор с данной концентрацией используют для внесения в исследуемые образцы.

Раствор хранят при температуре минус (20 ± 2) *С не более 3 мес.

Перед применением раствор выдерживают при комнатной температуре в темном месте не менее 20 мин.

6.2 Подготовка хроматографической системы

6.2.1 Включают хроматограф. Подготовку хроматографа к работе осуществляют в соответствии с Руководством по эксплуатации прибора.

6.2.2 Устанавливают следующие условия хроматографирования:

— скорость потока элюента — 0.1 см 3 /мин;

— объем вводимой пробы — 20 мм 3 :

— температура хроматографирования — (30 ± 1) в С;

— длина волны детектирования 280 нм.

Разделение проводят в режиме градиентного элюирования: с 0 % до 55 % мобильной фазы Б (6.1.4.2) за 25 мин.

6.2.3 Перед каждым измерением для оценки работы хроматографа проводят контрольное измерение. вводя в хроматограф образец с известным значением содержания антибиотика. В качестве такого образца может служить раствор антибиотика, приготовленный из реактива антибиотика с известным содержанием антибиотика.

6.3 Построение градуировочной характеристики

6.3.1 Для построения градуировочной зависимости анализируют серию градуировочных образцов. приготовленных по 6.1.6.2. в условиях, описанных в 6.2 и 7.

6.3.2 Используя программное обеспечение, прилагаемое к хроматографу, строят график зависимости массовой концентрации антибиотика от отношения площади хроматографического пика антибиотика к площади пика внутреннего стандарта.

Градуировочная характеристика считается приемлемой, если рассчитанное значение квадрата коэффициента корреляции для градуировочной характеристики каждого антибиотика составит не менее 0.98.

6.3.3 Градуировку проводят не реже одного раза в месяц, а также при изменении условий хроматографического анализа, при смене колонки, при замене реактивов или несоответствии результатов метрологическим требованиям.

6.4 Подготовка проб продуктов

6.4.1 Пробы молока и жидкой молочной продукции перемешивают путем перевертывания емкости с пробами не менее трех раз.

Пробы продуктов освобождают от упаковки, нагревают до температуры (20 ± 2) °С. аккуратно перемешивают и сразу же проводят измерение.

6.4.2 Пробы продуктов, содержащие ароматизаторы, пищевкусовые добавки (кофе, какао, фруктово ягодный или овощной наполнитель и т.д.), образующие с продуктом однородную структуру, а также неотделяемые пищевкусовые компоненты (например, кокосовую стружку), полностью освобождают от упаковки (при наличии), помещают в лабораторный стакан вместимостью 500-1000 см 3 и нагревают на водяной бане до температуры (32 ± 2) *С. после чего полностью переносят в стакан гомогенизатора и гомогенизируют в течение 1-3 мин при частоте вращения ножей от 2000 об/мин до 5000 об/мин до получения однородной массы. Затем пробу переносят в колбу вместимостью 500 см 3 с притертой пробкой и охлаждают до температуры (2012) *С. Пробу для анализа отбирают сразу же после гомогенизации во избежание ее расслоения.

6.4.3 Пробы творога, творожных продуктов и творожных полуфабрикатов нагревают до температуры (20 ± 2) °С. растирают а фарфоровой ступке до получения однородной консистенции и пере* носят в колбу вместимостью 500 см 3 с притертой пробкой.

6.4.4 Пробы сухих молочных продуктов растирают в ступке, тщательно перемешивая.

6.4.5 Пробы мороженого освобождают от глазури и вафель, оставляют при комнатной темпера* туре для отепления. Затем отделяют фрукты, орехи, изюм и другие отделяемые компоненты. При подготовке мороженого с наполнителями, обладающими текучестью (мягкая карамель, сироп, крем-брюле и т.д.), полностью растаявшее мороженое переносят в стакан гомогенизатора вместимостью от 500 см 3 до 1000 см 3 и гомогенизируют в течение 1-3 мин при частоте вращения ножей от 1000 об/мин до 5000 об/мин до получения однородной массы. Затем пробу переносят в колбу вместимостью 500 см 3 с притертой пробкой и охлаждают до температуры (20 ± 2) *С. Пробу для анализа отбирают сразу же после гомогенизации во избежание ее расслоения.

6.4.6 Пробу сыра и сырного продукта измельчают на металлической терке с мелкой перфорацией и аккуратно перемешивают в ступке.

6.4.7 Пробу масла, масляной пасты помещают в стакан вместимостью 100 см 3 , расплавляют на водяной бане при температуре (60 ± 2) *С и перемешивают до получения однородной эмульсии.

6.4.8 Подготовка проб продуктов для хроматографирования

6.4.8.1 В стакан вместимостью 100 см 3 помещают (5.000 ± 0.001) г продукта, подготовленного по

6.4.2 — 6.4.6. Добавляют 20 см 3 раствора элюекта мобильной фазы А (6.1.4.1) и аккуратно перемешивают Полученный раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 см 3 . ополаскивая стакан раствором элюекта мобильной фазы А (6.1.4.1). Объем раствора доводят раствором элюента мобильной фазы А (6.1.4.1) до метки.

Затем колбы с раствором помещают в ультразвуковую баню на 15 мин. охлаждают до температуры (20 ± 2) *С. Полученную смесь фильтруют через бумажный фильтр. В случае получения непрозрачного раствора допускается его центрифугирование при скорости вращения 15000 об/мин в течение 5 мин.

6.4.8.2 В мерную колбу вместимостью 50 см 3 помещают (5,000 ± 0.001) г масла, пасты масляной, подготовленных по 6.4.7. и добавляют 35 см 3 раствора элюента мобильной фазы А (6.1.4.1). Колбу помещают в ультразвуковую баню на 15 мин. охлаждают до температуры (20 1 2) *С. Объем раствора доводят раствором элюента мобильной фазы А (6.1.4.1) до метки. Полученную смесь центрифугируют при скорости вращения 15000 об/мин в течение 5 мин. Для анализа используем водную фракцию.

6.5 Подготовка проб для определения антибиотиков тетрациклиновой группы

В полипропиленовый флакон (виалу) вместимостью 15 см 3 помещают (1.000 ± 0,001) г пробы продукта, подготовленной по 6.4.1, или 10.0 см 3 пробы продукта, подготовленной по 6.4.8, добавляют 0.1 см 3 раствора внутреннего стандарта (6.1.6.3). Затем добавляют 3 см 3 ацетонитрила, закрывают крышкой и интенсивно перемешивают на встряхивателе в течение 3 мин. Оставляют на 15 мин в горизонтальном положении. Далее виалу с образцом помещают в центрифугу, предварительно охлажденную до температуры 4 °С. и центрифугируют при скорости вращения 4000 об/мин в течение 20 мин.

Полученную водную фракцию переносят в мерную пробирку вместимостью 10 см 3 и упаривают до 1 см 3 на нагревательном модуле в токе азота под вакуумом при температуре (40 ± 1) *С. К полученному остатку добавляют 3-5 см 3 буферного раствора (6.1.3). аккуратно перемешивают. Объем раствора доводят буферным раствором (6.1.3) до метки и помещают в ультразвуковую баню на 1 мин.

6.6 Подготовка проб для определения левомицетина, стрептомицина и антибиотиков пенициллиновой группы

В полипропиленовый флакон (виалу) вместимостью 15 см 3 помещают (1.000 ± 0,001) г пробы продукта, подготовленной по 6.4.1. или 10.0 см 3 пробы продукта, подготовленной по 6.4.8. Затем добавляют 3 см 3 ацетонитрила, закрывают крышкой и интенсивно перемешивают на встряхивателе в течение 3 мин. Оставляют на 15 мин в горизонтальном положении. Далее виалу с образцом помещают в центрифугу, предварительно охлажденную до температуры 4 *С. и центрифугируют при скорости вращения 4000 об/мин в течение 20 мин.

Полученную водную фракцию переносят в мерную пробирку вместимостью 10 см 3 и упаривают до 1 см 3 на нагревательном модуле в токе азота под вакуумом при температуре (40 ± 1) *С. К полученному остатку добавляют 3-5 см 3 буферного раствора (6.1.3). аккуратно перемешивают. Объем раствора доводят буферным раствором (6.1.3) до метки и помещают в ультразвуковую баню на 1 мин.

6.7 Проведение твердофазной экстракции

Для проведения твердофазной экстракции картридж для ТФЭ предварительно кондиционируют 6 см 3 50 %-ного раствора метанола и уравновешивают 6 см 3 деионизированной воды. Затем вносят пробу продукта, подготовленную по 6.5 или 6.6, и вновь промывают 6 см 3 деионизированной воды. Антибиотики элюируют с сорбента при помощи 6 см 3 раствора элюента мобильной фазы Б (6.1.4.2). Полученный элюат упаривают на нагревательном модуле досуха в токе азота под вакуумом при тем* пературе (40 ± 1) *С, затем растворяют раствором элюента мобильной фазы Б (6.1.4.2) до 0.5 см 3 , после чего используют для хроматографирования.

7 Условия проведения измерений

При выполнении измерений в лаборатории должны соблюдаться следующие условия:

— температура окружающего воздуха. (20 ± 5) в С;

— относительная влажность воздуха . (55 ± 25) %;

-атмосферное давление. (96 ±10) кПа;

— частота переменного тока. (50 ± 5) Гц:

— напряжение в сети . (220 ± 10) В.

8.1 Хроматографирование градуировочных растворов и анализируемой пробы продукта проводят в идентичных условиях.

8.2 Проводят два последовательных измерения. Подготовленную по 6.7 пробу вводят в колонку хроматографа и проводят хроматографический анализ в условиях, указанных в 6.2.2.

Если содержание антибиотиков в анализируемой пробе превышает значение максимального градуировочного уровня, то анализируемую пробу разводят в 10 или более раз мобильной фазой А и проводят повторные измерения.

9 Обработка результатов измерений

9.1 Обработка результатов измерений содержания антибиотиков тетрацикликовой группы, полученных с применением внутреннего стандарта

Определение содержания антибиотиков тетрациклиновой группы выполняют с помощью программного обеспечения, прилагаемого к хроматографу. С помощью программы обработки спектров вычисляют отношение площади пика определяемого антибиотика к площади пика внутреннего стандарта. Затем, используя программу обработки данных, рассчитывают содержание соответствующего антибиотика в подготовленной пробе.

9.2 Обработка результатов измерений содержания антибиотиков пенициллиновой группы, левомицетина (хлорамфеникола) и стрептомицина

Определение содержания антибиотиков выполняют с помощью программного обеспечения, прилагаемого к хроматографу. Используя градуировочный график, рассчитывают значение массовой концентрации соответствующего антибиотика в подготовленной пробе.

9.3 Массу пробы продукта, взятую для разведения, т, г. вычисляют по формуле

где т, — масса пробы продукта, подготовленная по 6.4.2 — 6.4.7, взятая для анализа и отобранная по 6.4.9. П

Иг — объем пробы, подготовленный по 6.4.8 и взятый для анализа (6.5 — 6.6). см 3 .

V, — общий объем растаора. полученный при разведении пробы продукта согласно 6.4.8. см 3 , (У, =50 см 3 ).

9.4 Массовую долю антибиотика в продукте X. млн 1 (мг/кг). вычисляют по формуле

где С — массовая концентрация антибиотика, найденная по градуировочному графику, мг/дм 3 :

Уз — объем элюата после выпаривания по 6.7. см 3 ;

т — масса пробы продукта, подготовленная по 6.4.1 и отобранная для анализа (6.S-6.6) или определенная по формуле (1). г.

За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение результатов двух по* следовательных измерений, выполненных в условиях повторяемости (ГОСТ ИСО 5725-1. пункт 3.14), если соблюдается условие приемлемости по 10.1.

9.5 Контроль точности результатов измерений

Приписанные характеристики погрешности и ее составляющих метода определения содержания антибиотиков в молоке и продуктах переработки молока при Р = 0.95 приведены в таблице 1.

Диапазон измерений массовой доли антибиотиков, млн 1 (мг/кг)

источник