Особенности экстракции левомицетина из пищевых продуктов

РАЗРАБОТАНЫ Институтом питания АМН СССР (Ляпков Б.Г. — рук. лаб. инструментальных методов анализа, д.м.н., Меламед Д.Б. — вед. научный сотрудник, к.х.н., Кирничная В.К. — инженер);

кафедрой общей гигиены Белорусского Государственного института усовершенствования врачей Минздрава СССР (Мурох В.И. — профессор, д.м.н.)

УТВЕРЖДАЮ

Заместитель главного государственного врача БССР В.Г.Жуковский 20 мая 1991 года N 4-18/1890

Предназначены для контроля остаточных количеств левомицетина в пищевых продуктах санитарно-эпидемиологическими станциями, а также заводскими и сельскохозяйственными лабораториями.

Среди ряда посторонних веществ, которые могут загрязнять различные пищевые продукты, важное место занимают лекарственные средства. Наиболее часто пищевые продукты загрязняются остатками лекарственных препаратов, применяемых для профилактики и лечения животных и птицы, ускорения их роста, улучшения качества и сохранности кормов и т.п. Номенклатура лекарств, используемых в животноводстве и ветеринарии, постоянно расширяется.

К сильнодействующим лекарственным препаратам, используемым в ветеринарии и животноводстве, относятся антибиотики. Известно большое число антибиотиков, природных и полусинтетических, обладающих различными свойствами, механизмом и спектром действия, распределением в организме животного, характером метаболизма и др.

Широкое применение антибиотиков в ветеринарии и животноводстве создает определенные проблемы с точки зрения гигиены питания, требует проведения соответствующих мероприятий для снижения уровня загрязненности продуктов этими веществами, а также организации контроля за остаточными количествами препаратов в продуктах животноводства.

При систематическом поступлении в организм человека с пищей антибиотики могут вызывать различные аллергические реакции, нарушение обмена веществ, дисбактериоз, подавлять активность некоторых ферментов, изменять микрофлору, способствовать распространению устойчивых форм микроорганизмов и т.д. Следует учитывать возможность отрицательного влияния антибиотиков в сырье для пищевой промышленности на проведение ряда технологических процессов по переработке мяса, рыбы, молока и других продуктов, кроме того, наличие антибиотиков может затруднять бактериологические исследования качества продуктов животного происхождения.

В мясе, печени, почках, молоке, твороге, сметане, сыре, яйце, рыбе, меде и других продуктах довольно часто обнаруживают остаточные количества антибиотиков, что предопределяет необходимость проведения выборочного, периодического или систематического их контроля. Некоторые из перечисленных продуктов являются диетическими (молоко, творог, сметана и др.), поэтому отсутствие в них токсических и лекарственных соединений особенно важно.

В СССР остаточные количества ряда антибиотиков регламентированы предельно-допустимыми концентрациями (ПДК)*. К ним относятся тетрациклины (0,01 ед./г), пенициллины (0,01 ед./г) и стрептомицин (0,5 ед./г).
________________
* Медико-биологические требования и санитарные нормы качества продовольственного сырья и пищевых продуктов. М. Издательство стандартов. 1990 г.

Для контроля уровней этих антибиотиков Минздравом СССР утверждены микробиологические методы определения, которые позволяют обнаруживать и идентифицировать группы указанных веществ на уровне ПДК.

Левомицетин (хлормицетин, хлорамфеникол) — эффективный синтетический антибиотик широкого спектра действия, запрещен к использованию в животноводстве и ветеринарии для лечения скота и птицы, мясо, молоко и яйца которых предназначены для питания людей. Это связано с токсичностью левомицетина, проявляющейся в аллергических реакциях, поражении кроветворных органов и др. Однако относительная дешевизна этого препарата и высокая антибактериальная активность приводят к нелегальному использованию его в относительно высоких масштабах.

Микробиологические методы неэффективны для анализа этого антибиотика в пищевых продуктах, т.к. найденные тест-культуры малочувствительны и не позволяют осуществлять контроль за остаточными количествами левомицетина хотя бы на уровне ПДК других антибиотиков, разрешенных к применению.

В связи с этим за рубежом наиболее часто применяют химические методы определения левомицетина в пищевых продуктах с использованием хроматографического разделения.

В настоящих методических рекомендациях впервые в СССР предпринята попытка применения для контроля остаточных количеств левомицетина в пищевых продуктах простого химического метода анализа, основанного на извлечении антибиотика экстракцией органическим растворителем, концентрировании экстракта, отделении левомицетина в тонком слое силикагеля от коэкстрактивных веществ и определении его после восстановления в виде производного с -диметиламинобензальдегидом.

Доступность реактивов и оборудования позволяет рекомендовать этот метод для серийных анализов пищевых продуктов в условиях санэпидстанций, заводских и сельскохозяйственных лабораторий.

Предел обнаружения левомицетина на хроматографической пластинке 5-10 нг в зоне. Относительное стандартное отклонение при визуальном определении не превышает 0,4, при спектрофотометрическом — 0,2. Метод позволяет проводить анализ левомицетина при содержании его 0,05 мг/кг продукта и выше.

Метод состоит из следующих основных стадий:

1. Отбор и подготовка пробы.

2. Извлечение левомицетина из пищевых продуктов и концентрированного экстракта.

3. Хроматографическое разделение, идентификация и ориентировочная оценка концентрации левомицетина в экстракте.

4. Подтверждение наличия левомицетина в пробе.

5. Количественное определение и расчет содержания левомицетина в продукте.

Аппаратура, материалы и реактивы

— Гомогенизатор тканей по ГОСТ 15906*
_______________
* На территории Российской Федерации документ не действует. Действуют ТУ 27-37-2514-81, ТУ 27-32-2680-86, являющиеся авторской разработкой. За дополнительной информацией обратитесь по ссылке. — Примечание изготовителя базы данных.

— Спектрофотометр СФ-26 или аналог

— Термостат ТС-80М-2 или аналог

— Азот, поверочный нулевой газ

— Центрифуга настольная по ТУ 5.375-4261* или аналог
________________
* ТУ, упомянутые здесь и далее по тексту, являются авторской разработкой. За дополнительной информацией обратитесь по ссылке. — Примечание изготовителя базы данных.

— Ротационный испаритель с ловушкой по ТУ 25-11-917

— Баня масляная или глицериновая

— Камера для тонкослойной хроматографии с притертой крышкой, например, стеклянный четырехугольный сосуд 195х195х200 мм завода «Дружная горка»

— Пластины для тонкослойной хроматографии «Силуфол» размером 15х15 см, ЧСФР или Сорбфил 100х100 (г.Краснодар) ТУ 26-11-17-89

— Ножницы

— Весы технические по ГОСТ 19491*
_______________
* На территории Российской Федерации документ не действует. Действует ГОСТ Р 53228-2008. — Примечание изготовителя базы данных.

— Весы аналитические по ГОСТ 24104*
_______________
* На территории Российской Федерации документ не действует. Действует ГОСТ Р 53228-2008. — Примечание изготовителя базы данных.

— Линейка

— Карандаш графитовый М или 2М

— Цилиндры мерные вместимостью 50 и 100 мл по ГОСТ 1770

— Колбы плоскодонные на 25 и 100 мл с НШ N 14,5 по ТУ 48-52

— Колбы мерные по 25 мл по ГОСТ 1770

— Пипетки на 5 и 10 мл по ГОСТ 20292*

Ознакомиться с документом вы можете, заказав бесплатную демонстрацию систем «Кодекс» и «Техэксперт».

источник

Сотрудниками РУП «Научно-практический центр гигиены» разработана новая сверхчувствительная методика определения содержания остаточных количеств левомицетина в сырье животного происхождения и пищевых продуктах методом ВЭЖХ/МС–МС.

Ее чувствительность составляет 0,2 мкг/кг.

Среди ряда веществ, контаминирующих продовольственное сырье и пищевые продукты, особое место занимают антибиотики. Данные вещества применяются при лечении больных животных, используются в качестве кормовых добавок и препаратов для стимуляции роста. Остаточные количества антибиотиков часто обнаруживают в молоке и молочных продуктах, в пищевых продуктах животного происхождения вследствие нарушения режима профилактики и лечения животных, а также в результате несоблюдения времени выдержки перед забоем.

Наличие антибиотика в пищевом сырье может изменить ход технологического процесса и повлиять на качество выпускаемой продукции. Кроме того, антибиотики могут специально вноситься в молоко производителями (фальсификация антибиотиками) для предотвращения преждевременного его скисания. Далее с продуктами питания они могут поступать в организм человека и оказывать неблагоприятное влияние на здоровье. Длительное использование в пищу продуктов, содержащих остаточное количество антибиотиков, может приводить к неблагоприятным для человека последствиям: возникновению аллергических реакций, дисбактериозов, анафилактического шока, увеличению антибиотикоустойчивости микрофлоры в организме, что впоследствии затрудняет выбор антибактериальных препаратов для лечения различных воспалительных заболеваний. Одним из таких антибиотиков является левомицетин.

Для экспортирования продукции за рубеж необходимо соблюдать требования международного ветеринарного кодекса и директив ЕС относительно выполнения ветеринарно-санитарных норм и правил при выращивании, производстве, переработке, хранении, транспортировании и реализации продукции. По этим причинам использование антибиотиков должно находиться под строгим санитарно-ветеринарным и гигиеническим контролем. Методы, применяемые для контроля наличия данных препаратов в продовольственном сырье и пищевых продуктах, можно разделить на микробиологические, физико-химические и иммунологические. Микробиологические методы (агародиффузный «чашечный» метод) определения основаны на измерении диаметра участков торможения роста бактерий, чувствительных к данному антибиотику (зон ингибиции). Эти методы являются сравнительно простыми и дешевыми, однако отличаются недостаточной чувствительностью, специфичностью и воспроизводимостью результатов.

Предпочтительным для контроля продовольственного сырья является иммуноферментный метод анализа, который обладает высокой чувствительностью, точностью, специфичностью, быстротой проведения анализа. Для определения левомицетина используют тест-системы типа «Ридаскрин Хлорамфинекол» и «МАХ SIGNAL Хлорамфинекол». Чувствительность этих методов в зависимости от анализируемого продукта составляет 0,01–0,25 мкг/кг (яйца, молоко, рыба, мясо). Данный метод широко используется для проведения скрининговых исследований. В случае установления фактов отсутствия антибиотиков в сырье с помощью иммуноферментного метода, обнаружение их в готовой продукции исключено. Недостатком указанного метода является то, что в настоящее время он не применим для готовой продукции. Это связано с тем, что производимые за рубежом тест-системы предназначены только для определения антибиотиков в продовольственном сырье, так как нормирование антибиотиков в странах Евросоюза проводится по сырью. Еще один недостаток — большой процент ложноположительных результатов. В случае получения положительного отклика, наличие антибиотика или его отсутствие в анализируемой продукции необходимо подтверждать другими методами анализа.

Методы высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) со спектрофотометрическим детектированием также используются для контроля содержания остаточных количеств левомицетина и его метаболитов в продовольственном сырье и пищевых продуктах. Однако чувствительность данных методов недостаточно велика и составляет 6,5—10,0 мкг/кг.

Также следует отметить, что ни один из вышеперечисленных методов не распространяется на пищевые продукты для детского и специализированного питания (для беременных и кормящих женщин, диетическое, спортивное), БАДы и пищевые добавки, содержащие продукты животноводства.

В странах Европы, Японии, США содержание хлорамфеникола регламентируется на уровне минимальной чувствительности метода, которая составляет 0,3 мкг/кг. В Беларуси в соответствии с требованиями СанПиГН до недавнего времени наличие левомицетина в мясе, мясных изделиях, молоке и молочных продуктах, продуктах для детского питания также не допускалось в пределах применяемого метода определения. В связи с введением в действие технического регламента Таможенного союза (ТР ТС 033/2013) содержание левомицетина в продуктах питания было четко регламентировано. Так, в сыром молоке, сыром обезжиренном молоке, сырых сливках и во всей молочной продукции содержание левомицетина (хлорамфеникола) не допускается более 0,01 мг/кг, а для продукции детского питания на молочной основе установлены еще более жесткие нормативы, при которых содержание левомицетина (хлорамфеникола) не должно превышать допустимого уровня 0,0003 мг/кг.

В настоящее время высокоточным аналитическим методом контроля антибиотиков является метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (далее — ВЭЖХ/МС–МС). Этот метод позволяет качественно и количественно определять остаточное количество антибиотиков как в сырье, так и в готовой продукции. Кроме того, с помощью указанного метода возможно разделение и идентификация различных действующих веществ, относящихся к одной группе. Данный метод имеет хорошую воспроизводимость и надежность, а также позволяет обнаруживать левомицетин в продукции животноводства на уровне 0,2 мкг/кг. По этой причине ВЭЖХ/МС–МС признан арбитражным методом определения антибиотиков в сырье и продукции животноводства в странах Евросоюза и России. Однако в Республике Беларусь метод ВЭЖХ/МС–МС для определения антибиотиков не применялся из-за отсутствия метрологически аттестованной методики.

Учитывая все вышесказанное, возникла необходимость разработки унифицированной методики определения остаточных количеств левомицетина во всех группах пищевых продуктов, в составе которых используется животноводческое сырье, методом ВЭЖХ/МС–МС, который бы соответствовал санитарно-гигиеническим требованиями Республики Беларусь, Таможенного союза и Евросоюза.

Сотрудниками Научно-практического центра гигиены разработана и внедрена в практику методика, которая позволяет контролировать содержание остаточных количеств левомицетина в различных видах пищевой продукции на уровне 0,2 мкг/кг. Метод определения основан на извлечении левомицетина органическим растворителем, очистке экстракта методом твердофазной экстракции и хроматографическом разделении с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии в обращенно-фазовом варианте с масс-спектрометрическим детектированием.

В настоящее время проводится определение содержания остаточных количеств левомицетина методом ВЭЖХ/МС–МС в сырье и продукции животноводства, а также в продуктах для детского питания на мясной и молочной основе. Внедрение данного метода позволило успешно вести контроль безопасности продукции, производимой на территории Беларуси, ввозимой из-за рубежа, а также предназначенной для поставки на экспорт.

Методика метрологически аттестована в БелГИМ и утверждена должным образом МВИ МН 4790–2013 «Определение содержания остаточных количеств левомицетина в сырье животного происхождения и пищевых продуктах методом ВЭЖХ/МС–МС».

Е. ШУПИЛОВА, научный сотрудник; О. ШУЛЯКОВСКАЯ, кандидат химических наук, заведующая лабораторией химии пищевых продуктов РУП «Научно-практический центр гигиены»

источник

1 УДК ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИБИОТИКОВ (ЛЕВОМИЦЕТИНА И ТЕТРАЦИКЛИНА) В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ С РАЗЛИЧНЫМИ МАТРИЦАМИ Л.И. Соколова*, К.О. Белюстова, Ю.О. Привар, Н.П. Шапкин, В.И. Разов ФГАОУ ВПО «Дальневосточный федеральный университет», , Россия, Приморский край, г. Владивосток, ул. Октябрьская, 27 Дата поступления в редакцию: Дата принятия в печать: * Пищевой продукт представляет собой многокомпонентную систему, содержащую белки, жиры, углеводы. Определение антибиотиков в этом случае осложняется влиянием мешающих компонентов различной природы. Предложены методики определения антибиотиков (левомицетина и тетрациклина) в пищевых продуктах с многокомпонентными матрицами (липидно-белковой, липидно-углеводной). Методики предусматривают экстракцию антибиотиков различными растворителями, очистку экстрактов и концентрирование антибиотиков на природных сорбентах (активированных углях и алюмосиликатах) с последующим элюированием определяемых компонентов этанолом и анализом методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с УФ-детектированием. Содержание антибиотиков определяли в продуктах, приобретенных в розничной сети г. Владивостока: липовый мед, произведенный в фермерских хозяйствах Приморского края и Республики Башкирия, боярышниковый мед, произведенный в фермерских хозяйствах Республики Башкирия, и печень куриная производства птицефабрик Приморского края. Методом «введено-найдено» определены степени извлечения левомицетина и тетрациклина из меда и левомицетина из печени куриной. Для левомицетина степень извлечения из меда составила 90 %, из печени куриной 78 %, для тетрациклина 82 % из образцов меда. Определено содержание левомицетина и тетрациклина в некоторых образцах меда и левомицетина в образцах печени куриной, приобретенных в розничной сети. В двух образцах меда липового обнаружены тетрациклин и левомицетин с содержанием антибиотиков 0,052 и 0,020 мг/кг соответственно. Содержание левомицетина в образцах печени куриной составило от 0,007 до 0,01 мг/кг. Левомицетин, тетрациклин, экстракция, сорбция, сорбент, концентрирование, высокоэффективная жидкостная хроматография Введение Здоровье населения во многом обусловливается тем, насколько экологически чистую пищу получает человек. Угроза некачественного питания серьезно выросла с усилением антропогенной нагрузки на объекты окружающей среды, повсеместным применением лекарственных средств лечения и профилактики заболеваний сельскохозяйственных животных [1]. В пищевых продуктах, полученных от таких животных, может содержаться остаточное количество антибиотиков. Систематическое поступление в организм антибиотиков служит фактором риска для различных аллергических реакций, нарушения обмена веществ, дисбактериоза, подавляет активность некоторых ферментов, изменяет микрофлору кишечника, способствует распространению некоторых форм микроорганизмов, провоцирует апластическую анемию и т.д. [2]. В 2001 году Советом министров ЕС приняты рекомендации по рациональному использованию антибиотиков, основной целью которых является сдерживание растущей антимикробной резистентности. В последнее время в качестве эффективных противоинфекционных средств используют хлорамфеникол (левомицетин) и тетрациклин, содержание которых в пищевых продуктах нормируется документом «Единые санитарно-эпидемиологические и гигиенические требования к товарам, подлежащим санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю)» [3]. В мясе, молоке, меде и других продуктах периодически обнаруживают остаточные количества этих лекарственных препаратов, что предопределяет необходимость проведения выборочного или систематического контроля [4]. Обеспечить полную безопасность продуктов, содержащих остаточные количества антибиотиков, может только контроль с помощью доступных и чувствительных методов. Ранее нами исследована возможность выделения и концентрирования левомицетина из пищевых продуктов с высоким содержанием жира с применением сорбентов на основе природных алюмосиликатов [5]. В отдельную группу можно выделить продукты с высоким содержанием углеводов, в частности мед, в котором углеводы являются основным матричным компонентом. Определение антибиотиков в этом продукте вызывает особый интерес в связи с его высокой популярностью как средства профилактики и лечения некоторых заболеваний. Наиболее часто для лечения болезней пчел применяют антибиотики левомицетин и тетрациклин как наиболее дешевые и доступные большинству производителей [6]. Пищевой продукт представляет собой многокомпонентную систему, содержащую белки, жиры, углеводы. Выделение антибиотиков осложняется 146

2 ISSN Food Processing: Techniques and Technology Vol. 38. No. 3 влиянием мешающих компонентов различной природы. Одним из наиболее сложных объектов является печень животных и продукты, приготавливаемые на ее основе. Содержание антибиотиков в субпродуктах, в частности, в печени сельскохозяйственных животных нормируется документом СанПиН Предел обнаружения антибиотиков в используемых методиках для левомицетина составляет 0,01 мг/кг и для тетрациклина 0,5 мг/кг, т.е. можно говорить о том, что методики, рекомендуемые к применению в Российской Федерации, гарантируют отсутствие антибиотиков на уровне 0,01 и 0,5 мг/кг [7]. В СанПиН «Дополнения и изменения 22 к СанПиН » от изменились пределы обнаружения антибиотиков левомицетина (менее 0,0003 мг/кг) и тетрациклина (менее 0,01 мг/кг) в мясе и продуктах его переработки, однако пределы обнаружения в субпродуктах остались прежними, что говорит о трудности выделения и идентификации антибиотиков. Содержание антибиотиков в меде не нормируется (СанПиН ). В СанПиН введены нормы только по антибиотику тетрациклину (предел обнаружения менее 0,01 мг/кг) [7, 8]. Цель настоящей работы разработка воспроизводимого и прецизионного метода выделения, концентрирования и анализа антибиотиков (левомицетина и тетрациклина) в пищевых продуктах с углеводной и многокомпонентными матрицами. Объекты и методы исследований Определяли содержание левомицетина в следующих пищевых продуктах, приобретенных в розничной сети г. Владивостока. Образцы с углеводной матрицей:липовый мед, произведенный в фермерских хозяйствах Приморского края и Республики Башкирия; боярышниковый мед, произведенный в фермерских хозяйствах Республики Башкирия. Образцы с многокомпонентной матрицей: печень куриная производства птицефабрик Приморского края. Степень извлечения антибиотиков из меда (углеводная матрица) определяли, используя в качестве модельной системы продукт, не содержащий антибиотиков, приобретенный в частном хозяйстве. Экстракцию антибиотиков проводили этилацетатом (хч): левомицетина из водного раствора меда, тетрациклина из раствора меда в 0,1 н растворе соляной кислоты. Для очистки экстрактов и концентрирования левомицетина использовали цеолит I, а для тетрациклина цеолит II. 1. Цеолит (природный алюмосиликат Чугуевского месторождения) с диаметром пор 0,2 0,1 мкм цеолит I. 2. Цеолит (природный алюмосиликат Чугуевского месторождения) с диаметром пор менее 0,2 мкм цеолит II. Состав сорбентов приведен в табл. 1. Таблица 1 Массовая доля элементов в образцах сорбентов, в пересчете на оксиды (%) Образец сорбента SiO 2 Al 2 O 3 Fe 2 O 3 K 2 O TiO 2 CaO ZnO ZrO 2 MnO H 2 O MgO Na 2 O Цеолит 69,01 12,64 1,29 3,17 0,01 2, ,01 9,68 0,47 1,10 Монтмориллонит 63,03 18,50 5,24 1,44 0,22 0,12 0,11-1, Сорбенты предварительно кипятили в этаноле и промывали дистиллированной водой до получения прозрачных смывов, не поглощающих в УФобласти спектра. Степень извлечения антибиотиков из печени куриной изучали, используя в качестве модельной системы продукт, приобретенный в розничной сети. Сложность определения состояла в том, что во всех пробах, доступных для постановки эксперимента, были обнаружены следовые количества левомицетина. По-видимому, данный препарат применялся для лечения и профилактики заболеваний у птицы при выращивании ее для производства пищевой продукции. Поэтому при определении степени извлечения антибиотика параллельно выполняли анализ холостой пробы, затем вносили в нее известное количество левомицетина и рассчитывали извлечение с учетом холостой пробы. Определение тетрациклина в куриной печени проводилось совместно с левомицетином методом УФ-спектрометрии экспресс-определение (скрининг-анализ). Однако наиболее важным и информативным является анализ методом ВЭЖХ, позволяющий не только разделить антибиотики, но и определить их содержание в исследуемом продукте. Для очистки экстрактов использовали активированный уголь (БАУ), для концентрирования антибиотиков применяли сорбент монтмориллонит (глинозем). 1. Монтмориллонит немодифицированный (прокаленный при 600 о С). 2. Монтмориллонит, модифицированный хитозаном, получен на кафедре неорганической и элементоорганической химии Дальневосточного федерального университета. 147

3 Аппаратура и условия анализа ВЭЖХ-анализ проводили на жидкостном хроматографе Shimadzu LС-20 Prominence (Япония) с УФ-детектором, длина волны: 286 нм (для определения левомицетина), 356 нм и 275 нм (для определения тетрациклина). Колонка ODS С18 Zorbax (4,6 150 мм). Подвижные фазы: ацетонитрил вода (20/80 об/об), ацетонитрил вода (30/70 об/об) с добавкой 0,6 % ортофосфорной кислоты (при определении тетрациклина). Анализ левомицетина проводили в режиме градиента скорости потока подвижной фазы: с 0,1 по 5 мин скорость 0,5 мл/мин, с 5 1 мл/мин, тетрациклина в режиме изократического элюирования при скорости потока 0,5 мл/мин. Спектрофотометрический анализ проводили на приборе UV-mini 1240 Shimadzu (Япония). В качестве растворителей использовали дистиллированную воду, доведенную до ph 6. Диапазон используемых длин волн нм. Длина кварцевой кюветы 1 см. Рентгеноструктурный анализ на рентгеновском дифрактометре Bruker D8 ADVANCE, спектрометре ультрабыстрых задержанных совпадений при помощи сцинтилляционных пластических детекторов диаметром мм и ФЭУ-87 на базе анализатора NOKIA-LP Определение степени извлечения левомицетина из меда Навески меда массой 25 г помещали в конические колбы на 100 мл и добавляли по 1 мл раствора левомицетина в дистиллированной воде, концентрацией 0,01 мг/мл. Растворяли навески в 30 мл дистиллированной воды. Добавляли по 0,5 мл реактива Карреса (15 г гексацианоферрата калия, растворенного в 100 мл дистиллированной воды, и 20,4 г сульфата цинка, растворенного в 100 мл дистиллированной воды). Смесь центрифугировали при 4000 об/мин в течение 10 мин. Верхний слой отделяли декантацией и экстрагировали этилацетатом (3х20 мл), органический слой пропускали через безводный сульфат натрия. Упаривали досуха на роторном испарителе, перерастворяли остаток в дистиллированной воде. Полученные растворы пропускали через цеолит I. Элюат отбрасывали. Смывали антибиотик с сорбента 4 мл ацетонитрила. Полученные растворы упаривали досуха на роторном испарителе, перерастворяли в 0,5 мл этанола и анализировали методом УФ-ВЭЖХ при 286 нм. Определение степени извлечения тетрациклина из меда Навески меда массой 35 г помещали в конические колбы на 100 мл и добавляли по 1 мл раствора тетрациклина в дистиллированной воде с концентрацией 0,001 мг/мл. Растворяли навески в 30 мл 0,1 н соляной кислоты. Добавляли 2 мл 10%-ной ортофосфорной кислоты и 1 мл раствора сульфата цинка (20,4 г сульфата цинка, растворенного в 100 мл дистиллированной воды). Смесь центрифугировали при 4000 об/мин в течение 10 мин. Верхний слой отделяли декантацией и экстрагировали этилацетатом (3х20 мл), экстракт собирали в колбу через безводный сульфат натрия. Упаривали смесь на роторном испарителе, перерастворяли остаток в дистиллированной воде. Полученные растворы пропускали через цеолит II. Элюат отбрасывали. Смывали антибиотик с сорбента 1 мл 0,1 н раствора гидроксида натрия. Полученные растворы анализировали методом УФ-ВЭЖХ при 275 и 356 нм. Определение степени извлечения левомицетина из печени куриной Навески гомогенизированной печени (10 г) помещали в плоскодонные колбы объемом 100 мл и вносили 1 мл раствора левомицетина в дистиллированной воде, концентрацией 0,01 мг/мл, тщательно перемешивали и оставляли на 1,5 2 ч при температуре 5 о С. Затем добавляли 10 мл дистиллированной воды и помещали на лабораторный шейкер на 10 мин, после этого добавляли 1 мл этилацетата и центрифугировали в течение 20 мин при 4000 об/мин. Верхний слой сливали и фильтровали через фильтр синяя лента. Водно-органический слой очищали, пропуская через слой активированного угля (высота сорбента в колонке 12 см, скорость 1 капля в секунду). Далее через колонку с углем пропускали 4 мл этилового спирта, получали фракцию 1, которую подвергали концентрированию на мотмориллоните (высота слоя сорбента в колонке 6 см, скорость 1 капля в секунду). Элюат отбрасывали. Промывали монтмориллонит 3 мл этанола фракция 2. Фракции 1 и 2 объединяли и упаривали на песчаной бане при температуре около 90 о С до 1 мл. Полученные растворы анализировали методом УФ-ВЭЖХ при 286 нм. Исследование сорбции левомицетина и тетрациклина при совместном присутствии на монтмориллоните В водно-органический экстракт, полученный из куриной печени, по методике, описанной выше, вносили стандартные растворы левомицетина и тетрациклина. Концентрация каждого из антибиотиков в экстракте составила 0,01 мг/мл. Экстракты пропускали через монтмориллонит, модифицированный хитозаном. Антибиотики десорбировали последовательно порциями 3 мл этилового спирта (десорбция левомицетина) и 3 мл дистиллированной воды, подкисленной соляной кислотой до ph 4 (десорбция тетрациклина). Спиртовую и водную фракции фотометрировали в диапазоне длин волн нм. Результаты и их обсуждение Антибиотики, как правило, содержатся в пищевых продуктах в следовых количествах, а сами пищевые продукты это сложные многокомпонентные системы. Поэтому для количественного анализа важно максимально полно очистить пищевой продукт от балластных веществ, мешающих определению антибиотика. К таким веществам относят липиды, белки, углеводы, органические кислоты, пигменты и т.п. Пробоподготовка для анализа пищевых продуктов при определении антибиотиков включает в себя следующие этапы: экстракция определяемого антибиотика, очистка 148

4 ISSN Food Processing: Techniques and Technology Vol. 38. No. 3 экстракта от балластных веществ, концентрирование антибиотика. Ранее нами предложена методика анализа антибиотика левомицетина в пищевых продуктах с высоким содержанием жира [5] путем применения природных алюмосиликатов, таких как вермикулит, смесь вермикулита с активированным углем и цеолит, модифицированный хитозаном. Однако при извлечении левомицетина из углеводной матрицы (мед) эти сорбенты не очищали экстракты антибиотика в достаточной для хроматографического анализа степени. Наиболее целесообразным оказалось использование цеолита I, которое позволило не только очистить полученные экстракты в достаточной для хроматографического анализа степени, но и сконцентрировать левомицетин в небольшом объеме растворителя. В методиках выделения тетрациклина [9] из меда экстракцию проводят либо кислотными, либо щелочными растворами. Нами был проведен следующий эксперимент: навески исследуемого образца с добавкой тетрациклина перемешивали с 0,1 М раствором соляной кислоты и параллельно с 10 % раствором гидроксида натрия. Полученные смеси пропускали через цеолит I и цеолит II. С сорбентов антибиотик элюировали дистиллированной водой с рн 4 и рн 9 соответственно. Однако при хроматографическом анализе тетрациклин не был обнаружен. Дополнительно в экстракционную смесь вводили этилацетат. При использовании цеолита I получили мутные, не пригодные для дальнейшего хроматографического анализа растворы. При применении цеолита II растворы прозрачные. Таким образом, для определения тетрациклина в меде целесообразно использовать экстракцию этилацетатом, подкисленным до рн 4, а концентрирование антибиотика на цеолите II. Для проверки правильности методики определена степень извлечения тетрациклина и левомицетина из меда методом «введено-найдено». При практическом осуществлении этого метода в образец, заведомо не содержащий определяемое вещество, вносится его определенное количество. Полученные результаты представлены в табл. 2. В табл. 3 даны результаты определения левомицетина и тетрациклина в образцах меда, приобретенных в розничной сети г. Владивостока. Таблица 2 Степень извлечения антибиотика из продукта с углеводной матрицей Исследуемый продукт Мед, не содержащий антибиотиков Исследуемое вещество Тетрациклин Левомицетин Степень извлечения левомицетина, % 82,40 0,50 90,20 0,30 Таблица 3 Содержание антибиотиков в исследованных образцах меда Исследуемый продукт Содержание левомицетина, мг/кг Содержание тетрациклина, мг/кг Мед липовый приморский Не обнаружено 0,052±0,002 Мед липовый башкирский 0,020 0,001 Не обнаружено Мед боярышниковый башкирский Не обнаружено Не обнаружено ПДК левомицетина для пищевых продуктов составляет менее 0,003 мг/кг (предел обнаружения методик, рекомендованных для определения левомицетина, 0,003 мг/кг). Превышение ПДК левомицетина обнаружено в образце «Мед липовый башкирский». ПДК тетрациклина для пищевых продуктов составляет менее 0,01 мг/кг (предел обнаружения методик, рекомендованных для определения тетрациклина, 0,01 мг/кг). Превышение ПДК тетрациклина установлено в образце «Мед липовый приморский». Особую трудность для проведения аналитических определений представляют продукты со сложными многокомпонентными матрицами. Следует учитывать и факт совместного применения антибиотиков. Одним из распространенных видов пищевой продукции с углеводно-липидной матрицей является печень. В доступных источниках отсутствует информация об обнаружении антибиотиков в куриной печени, реализуемой на территории Приморского края. Предпринята попытка извлечения антибиотиков левомицетина и тетрациклина из куриной печени по ранее разработанным методикам. Однако это не позволило провести выделение, концентрирование и последующий их анализ. Печень достаточно сложный по составу объект для исследования, содержащий различные классы липидов (триглицериды, фосфолипиды, холестерин и др.), ферменты, белки, гликоген (животный полисахарид), содержание которого колеблется от 2 до 8 %. Все эти вещества, несомненно, мешают определению исследуемых соединений. 149

5 Для извлечения и концентрирования левомицетина из пищевых продуктов с липидно-углеводной матрицей (печени куриной) исследована возможность применения природного алюмосиликата монтмориллонита. Для изучения природы и механизма сорбции выполнен рентгеноструктурный анализ сорбента. В результате установлено, что левомицетин при взаимодействии с сорбентом проникает в поры, уменьшает размер пор сорбента, так называемых «ловушек», захватывающих антибиотики по механизму специфических взаимодействий (сорбционных, гидрофильно-гидрофобных и др.). Методом позитронной аннигиляционной спектроскопии рассчитан удельный объем «ловушек» сорбента, который составил для монтмориллонита 2,87 нм 3, монтмориллонита, модифицированного хитозаном, 14,95 нм 3. Показано, что монтмориллонит позволяет эффективно извлекать левомицетин из исследуемой матрицы, однако при элюировании различными растворителями экстракты со степенью чистоты, достаточной для анализа методом ВЭЖХ, не были получены. Степень извлечения левомицетина, определенная методом «введено-найдено», не превышала 27 %. По-видимому, определению мешают липофильные компоненты, которые, предположительно, могут связываться с молекулами антибиотика и существенно снижать концентрацию его в свободной форме в экстракте и частично перекрывать область определения левомицетина на хроматограмме. Следовательно, для точного количественного анализа антибиотика необходимо применять доочистку экстрактов. Для этой цели применяли ранее отработанный нами способ очистки с использованием активированного угля [5]. При применении активированного угля и последующего концентрирования на монтмориллоните степень извлечения левомицетина составила (78,5 4,6) %. Исследовано несколько образцов куриной печени, полученной на местной птицефабрике в разное время года, в некоторых образцах был обнаружен левомицетин в следовых количествах (от 0,007 до 0,01 мг/кг). Совместное определение антибиотиков левомицетина и тетрациклина Исследование спектров поглощения антибиотиков позволило предположить возможность их совместного экспресс-определения в экстракте (максимум поглощения левомицетина 286 нм, тетрациклина два максимума: 275 и 386 нм). В водноорганический экстракт куриной печени вносили некоторое количество левомицетина и тетрациклина, затем проводили сорбцию антибиотиков на монтмориллоните, модифицированном и не модифицированном хитозаном. Показано, что для совместного определения левомицетина и тетрациклина наиболее эффективен монтмориллонит, модифицированный хитозаном. Возможно, модифицирование хитозаном позволяет увеличить сорбционную активность сорбента к исследуемым антибиотикам благодаря появлению специфических взаимодействий. Левомицентин и тетрациклин последовательно элюировали с сорбента этанолом и подкисленной до рн 4 дистиллированной водой. Выводы 1. Предложены методики анализа антибиотиков левомицетина и тетрациклина в пищевых продуктах с углеводной (мед) и липидно-углеводной (печень куриная) матрицами. 2. Показана возможность применения сорбентов на основе модифицированных алюмосиликатов для концентрирования антибиотиков левомицетина и тетрациклина при их совместном присутствии в пищевом продукте. 3. Методом «введено-найдено» определены степени извлечения левомицетина и тетрациклина из меда и левомицетина из печени куриной. Для левомицетина степень извлечения из меда составила 90 %, из печени куриной 78 %, для тетрациклина из образцов меда 82 %. 4. Определено содержание левомицетина и тетрациклина в меде и левомицетина в печени куриной, приобретенных в розничной сети г. Владивостока. В двух образцах меда липового обнаружены тетрациклин и левомицетин с содержанием антибиотиков 0,052 и 0,020 мг/кг соответственно. Содержание левомицетина в образцах печени куриной составило от 0,007 до 0,01 мг/кг. Список литературы 1. Бельтюкова, С.В. Методы определения антибиотиков в пищевых продуктах / С.В. Бельтюкова, Е.О. Ливенцова // Методы и объекты химического анализа С Купинец, Л.Е. Проблемы производства экологически чистой продукции в АПК: международный и национальный аспекты / Л.Е. Купинец, С.К. Харичков; Нац. акад. наук, Ин-т проблем рынка и экон. экоисслед. М.: ИПРЭЭИ, с. 3. Единые санитарно-эпидемиологические и гигиенические требования к товарам, подлежащим санитарноэпидемиологическому надзору (контролю). Введ М.: Изд-во стандартов, Криничная, В.К. Контроль содержания антибиотиков в пищевых продуктах хроматографическими методами / В.К. Криничная // Пищевая промышленность С Белюстова, К.О. Определение содержания левомицетина в пищевых продуктах с различной массовой долей жира / К.О. Белюстова, Л.И. Соколова // Техника и технология пищевых производств С Determination of Chloramphenicol in Honey, Shrimp, and Poultry Meat with Liquid Chromatography Mass Spectrometry: Validation of the Method According to Commission Decision 2002/657/EC/ Caroline Douny, Joëlle Widart, Edwin de Pauw, Guy Maghuin-Rogister, Marie-Louise Scippo // Food Anal. Methods Vol с. 150

источник

Владельцы патента RU 2431829:

Группа изобретений относится к концентрированию и определению антибиотика левомицетина в пищевых продуктах методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Сущность изобретения: левомицетин экстрагируют из пробы ацетонитрилом, отделяют на центрифуге раствор, в котором находится антибиотик, к центрифугату добавляют сорбент — вермикулит при массовом соотношении вермикулита, равном 0,1 г сорбента на 1 г жира в пробе, и встряхивают в течение 30 минут, затем раствор отделяют и пропускают через смесь сорбентов — активированного угля и вермикулита, взятых в массовом соотношении, равном 1:1, и промывают дистиллированной водой, элюируют левомицетин этанолом, элюат упаривают досуха на водяной бане и охлаждают до комнатной температуры, затем остаток растворяют в подвижной фазе (ацетонитрил:вода, 70:30 об./об.), раствор левомицетина переносят дозатором в сухие виалы и количественно определяют левомицетин методом ОФ ВЭЖХ с УФ-детектированием при длине волны 278 нм; содержание антибиотика рассчитывают при помощи градуировочного графика. Достигается повышение точности и безопасности анализа. 2 н.п. ф-лы, 1 табл., 4 ил.

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам определения антибиотика левомицетина в пищевых продуктах методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Антибиотики, в частности левомицетин (хлорамфеникол), используют в качестве эффективных противоинфекционных средств в ветеринарии и при профилактике заболеваний домашней птицы и скота. При этом антибиотик способен переходить в мясо, молоко животных, яйца птиц и другие пищевые продукты. Так как в последние годы в мире наблюдается устойчивая тенденция ужесточения требований к качеству пищевых продуктов, необходима разработка и введение в практику новых, более эффективных и чувствительных методов анализа.

Существуют различные методы определения левомицетина в пищевых продуктах (иммуноферментный анализ, химические методы (качественные реакции на данный антибиотик с различными специально подобранными реагентами), физико-химические методы (вольтамперометрия, полярография, спектрофотометрия), тонкослойная хроматография, газовая хроматография). При использовании данных методов анализа часто сталкиваются с определенными трудностями, например необходимостью использования специфических, редких и достаточно дорогостоящих реактивов; невозможностью определения сразу нескольких препаратов при совместном присутствии и неудовлетворительным нижним пределом обнаружения антибиотика; необходимостью использования предколонки (для газовой хроматографии).

Одним из наиболее перспективных методов определения антибиотика левомицетина является метод обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ), который дает возможность извлекать, разделять, идентифицировать и количественно определять лекарственные препараты в биологических жидкостях.

Известен способ количественного определения левомицетина в пищевых продуктах измерением массовой доли антибиотика методом ОФ ВЭЖХ с фотометрическим детектированием с использованием жидкостного хроматографа «Люмахром» [1]. Способ состоит в экстракции левомицетина из образца дистиллированной водой, дальнейшей очистке экстракта при помощи концентрирующего патрона ДИАПАК-C₁₆ и в определении левомицетина методом ОФ ВЭЖХ с использованием фотометрического детектора (254 нм). Патроны ДИАПАК-С₁₆ представляют собой корпусы из химически устойчивого полимера, заполненные высококачественными химически модифицированными сорбентами на основе силикагеля с привитыми гексадецильными группами. Способ имеет ряд недостатков: левомицетин из проб экстрагируется водой, что затрудняет дальнейший анализ, т.к. экстракты получаются достаточно загрязненными посторонними, мешающими определению антибиотика веществами; способ предполагает использование летучих и токсичных растворителей — хлороформа и гексана; определение левомицетина методом ОФ ВЭЖХ с ультрафиолетовым детектором проводят при длине волны 254 нм. Однако в этой области спектра интенсивное поглощение характерно для практически всех веществ, содержащих ароматический цикл; следовательно, известный метод определения левомицетина не гарантирует точных результатов.

Исследована возможность патронов ДИАПАК-C₁₆ для концентрирования антибиотиков цефазолина и левомицетина из разбавленных растворов с последующим их определением методом ОФ-ВЭЖХ [2]. Сорбцию препаратов проводят в статическом и динамическом режимах, антибиотики десорбируют ацетонитрилом, полученные растворы анализируют методом ОФ ВЭЖХ с использованием подвижной фазы (ацетонитрил-вода, 50:50 об./об.); колонки Zorbax ODS C₁₈ (15×0,46 см), рабочие длины волн — 210 и 254 нм. Однако данная методика позволяет осуществлять выделение и анализ антибиотиков из разбавленных водных растворов фармацевтических препаратов и не адаптирована для анализа пищевых продуктов с высоким содержанием жира.

Известен способ определения левомицетина в мясе краба и в креветках с помощью ВЭЖХ с масс-детектированием [3]. Антибиотик экстрагируют этилацетатом, в качестве подвижной фазы используют метанол. Недостатками данного способа являются: применение высокотоксичного метанола в качестве подвижной фазы; использование дорогостоящего и сложного в освоении жидкостного хроматографа с масс-детектором, что затрудняет широкое применение известного способа анализа.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к способу определения левомицетина в пищевых продуктах является способ извлечения антибиотиков из пищевой продукции органическими растворителями — метанолом и ацетонитрилом с последующей очисткой экстракта растворами Карреза (водный раствор Zn(СН₃СОО)₂ и K₄[Fe(CN)₆]×3H₂O), после чего экстракт обрабатывают диэтиловым эфиром для удаления липидов и анализируют методом ОФ ВЭЖХ с использованием подвижной фазы (ацетонитрил:вода, 70:30 об./об.) (колонка Zorbax ODS C₁₈ (15×0,46 см), с УФ-детектированием при 220, 254 и 273 нм) [4]. Количество антибиотика в пробе определяют с помощью градуировочного графика. Предел обнаружения антибиотика левомицетина в способе-прототипе составляет 0,9±0,2 нг в одной порции раствора, вводимой в хроматограф для анализа. Недостатками данного способа являются необходимость применения высокотоксичного реагента — метанола, а также недостаточная точность определения левомицетина вследствие частичного осаждения антибиотика на хлопьевидном осадке гексацианоферрата цинка.

Задачей заявляемого изобретения является разработка воспроизводимого, прецизионного способа выделения и концентрирования левомицетина из пищевых продуктов, а также его количественного определения.

Поставленная задача достигается тем, что левомицетин экстрагируют из пробы ацетонитрилом, отделяют на центрифуге раствор, в котором находится антибиотик, к центрифугату добавляют сорбент — вермикулит (массовое соотношение которого 0,1 г сорбента на 1 г жира в пробе) и встряхивают в течение 30 минут, затем раствор отделяют и пропускают через смесь сорбентов — активированного угля и вермикулита, взятых в массовом соотношении, равном 1:1, и промывают дистиллированной водой, элюируют левомицетин этанолом, элюат упаривают досуха на водяной бане и охлаждают до комнатной температуры, затем остаток растворяют в подвижной фазе (ацетонитрил:вода, 70:30 об./об.), раствор левомицетина переносят дозатором в сухие виалы и количественно определяют левомицетин методом ОФ ВЭЖХ с УФ-детектированием при длине волны 278 нм; содержание антибиотика рассчитывают при помощи градуировочного графика.

Поставленная задача наилучшим образом решается новыми, ранее не известными из уровня техники условиями пробоподготовки образца, а именно:

— последовательным применением сорбентов:

— вначале — вермикулита, массовое соотношение которого 0,1 г сорбента на 1 г жира в пробе;

— затем — смеси активированного угля и вермикулита при их массовом соотношении, равном 1:1;

— последующей переэкстракцией антибиотика этанолом.

В заявляемом способе используют вермикулит (природный цеолит) Кокшаровского месторождения Приморского края.

Указанные существенные отличительные признаки заявляемого изобретения обеспечивают концентрирование антибиотика, очистку экстракта от мешающих анализу компонентов, что особенно актуально при анализе пищевых продуктов с высоким (>30%) содержанием жира, и позволяют определить левомицетин известным ОФ ВЭЖХ-методом с достаточной степенью точности.

Техническим результатом предлагаемого способа определения содержания левомицетина в пищевых продуктах является повышение точности количественного определения антибиотика в пищевых продуктах с различным содержанием жира, а также снижение токсичности проведения аналитических исследований.

Способ определения содержания левомицетина в пищевых продуктах осуществляют следующим образом. Левомицетин экстрагируют из пробы ацетонитрилом и отделяют раствор, в котором находится антибиотик с примесями, от осадка (свернувшийся белок). В полученный раствор антибиотика в ацетонитриле добавляют вермикулит, массовое соотношение которого 0,1 г сорбента на 1 г жира в пробе, встряхивают колбу со смесью в течение 30 минут на встряхивателе и отделяют раствор от сорбента. Отфильтрованный раствор пропускают через смесь сорбентов (активированный уголь и вермикулит, взятых при массовом соотношении, равном 1:1), промывают дистиллированной водой и элюируют антибиотик этанолом. Элюат в круглодонных колбах упаривают досуха на водяной бане, охлаждают до комнатной температуры и растворяют в подвижной фазе (ацетонитрил:вода, 70:30 об./об.). Раствор левомицетина переносят дозатором в сухие виалы и количественно определяют антибиотик методом ОФ ВЭЖХ с УФ-детектированием при длине волны 278 нм; содержание антибиотика рассчитывают при помощи градуировочного графика.

Экспериментально установлена необходимость последовательного применения сорбентов: вначале — вермикулита для дополнительной очистки экстракта от примесей. Необходимость использования вермикулита при его массовом соотношении, равном 0,1 г сорбента на 1 г жира в пробе, подтверждена экспериментальным путем и обусловлена тем, что при статической сорбции из раствора на вермикулите происходит сорбция примесей (липиды, белки и др.), которые присутствуют в экстракте. Таким образом, достигается предварительная очистка экстракта от балластных веществ.

Для сорбции левомицетина из раствора после отделения вермикулита используется бинарный сорбент (активированный уголь и вермикулит при их массовом соотношении, равном 1:1), применение которого позволяет не только проводить доочистку экстракта от соэкстрагированных примесей, но и концентрировать левомицетин в количествах, необходимых для хроматографического анализа. Активированный уголь сорбирует примеси из раствора левомицетина в этаноле, обеспечивает получение прозрачного и пригодного для ОФ ВЭЖХ-анализа раствора левомицетина. Для того чтобы минимизировать возможность сорбции антибиотика на угле, необходимое количество активированного угля предварительно рассчитывают по формуле (1), если содержание жира в продукте ≥3,9%; и по формуле (2), если содержание жира в продукте меньше чем 3,9%:

m_R — масса остатка после экстракции ацетонитрилом;

f — содержание жира в исследуемом продукте.

где m_S2 — масса сорбента, необходимая для анализа пищевого продукта, с содержанием жира менее 3,9%,

f — содержание жира в исследуемом продукте.

После расчета навески активированного угля, необходимой для анализа продукта на левомицетин, готовят смесь сорбентов при их массовом соотношении, равном 1:1; такое соотношение сорбентов является оптимальным и установлено экспериментально.

Изменение соотношения активированный уголь:вермикулит приводит либо к уменьшению степени извлечения антибиотика, либо к получению мутных растворов, непригодных для анализа методом ОФ ВЭЖХ.

Элюирование левомицетина осуществляется этанолом, поскольку этот растворитель обладает достаточной полярностью для наиболее полного элюирования левомицетина с сорбента. Менее полярные растворители извлекают с сорбента и неполярные примеси, что приводит к уменьшению точности анализа антибиотика заявляемым способом. Не маловажным при выборе растворителя на стадии элюирования левомицетина является меньшая токсичность этанола по сравнению с метанолом, используемым в способе-прототипе.

Заявляемый способ впервые позволяет анализировать пищевые продукты с различным содержанием жира — от 1,0% до 60% с достаточно высокой степенью извлечения антибиотика, а именно (98,5-90)%, что подтверждается данными таблицы.

Правильность предлагаемого способа определения содержания левомицетина в пищевых продуктах подтверждена методом «введено-найдено» и экспериментальными данными (примеры 1-3); хроматограммы представлены на фигурах 1-4.

На фиг.1 представлена хроматограмма стандартного раствора левомицетина с концентрацией антибиотика 0,01 мг/мл, приготовленного из фармацевтического препарата «Хлорамфеникола натрия сукцинат», приобретенного в аптечной сети. Пик вещества со временем удерживания 2,492 мин принят за пик левомицетина.

На фиг.2 представлена хроматограмма раствора левомицетина с концентрацией 0,01 мг/мл, внесенного в пищевой продукт (растительный маргарин, жирностью 40%) и выделенного из него по заявляемому способу. Пик вещества со временем удерживания 2,429 мин принят за пик левомицетина.

На фиг.3 представлена хроматограмма раствора левомицетина, выделенного по заявляемому способу из пищевого продукта «яйцо куриное». Пик вещества со временем удерживания 2,418 мин принят за пик левомицетина.

На фиг.4 представлена хроматограмма раствора левомицетина с концентрацией 0,01 мг/мл, внесенного в пищевой продукт (растительный маргарин, жирностью 60%) и выделенного из него по заявляемому способу. Пик вещества со временем удерживания 2,437 мин принят за пик левомицетина.

Возможность осуществления заявляемого способа иллюстрируется примерами.

Пример 1. Определение левомицетина (хлорамфеникола) в яйцах куриных

В коническую колбу вместимостью 100,0 мл вносят 50 г куриных яиц, предварительно тщательно гомогенизированных в стеклянной посуде, приливают 100 мл ацетонитрила (хч) и ставят на встряхиватель на 2 часа. Полученный экстракт фильтруют через стекловату, помещенную в стеклянную воронку и промытую 5 мл ацетонитрила. В полученный раствор добавляют 1 г вермикулита. Колбу с экстрактом и сорбентом помещают на встряхиватель на 30 минут, фильтруют раствор и пропускают через бинарный сорбент — смесь 3,85 г активированного угля и 3,85 г вермикулита, после чего сорбенты промывают 10 мл дистиллированной воды. Затем левомицетин элюируют 10 мл этанола и упаривают раствор на водяной бане в круглодонной колбе досуха. Колбу охлаждают на воздухе до комнатной температуры и ополаскивают 1 мл подвижной фазы (ацетонитрил:вода, 70:30 об./об.). Раствор антибиотика в подвижной фазе собирают дозатором на 1000 мкл и переносят в сухую чистую виалу. Количество антибиотика находят методом ОФ ВЭЖХ (жидкостный хроматограф Shimadzu LC-6A с УФ-детектором, колонка Zorbax ODS C₁₈ (15×0,46 см), подвижная фаза (ацетонитрил:вода, 70:30 об./об.) при рабочей длине волны 278 нм. Содержание левомицетина (мг/кг), рассчитанное по методу градуировочного графика составило: 0,0140±0,0011 мг/кг; степень извлечения — 98,9% (фиг.3).

Пример 2. Определение левомицетина в маргарине с жирностью 40,0%

Определение антибиотика проводили по примеру 1, но перед экстракцией 50 г маргарина растопили в колбе при температуре 55°С (достаточная температура, чтобы растопить жир, содержащийся в маргарине, и не разрушить антибиотик), добавили 1 мл раствора левомицетина с концентрацией 0,1 мг/мл. Затем, не охлаждая образец, прибавили 100 мл ацетонитрила и проводили экстракцию левомицетина на встряхивателе в течение 3 часов при температуре 50°С. В полученный раствор добавили 1 г вермикулита. Колбу с экстрактом и сорбентом помещали на встряхиватель на 30 минут, отфильтровывали раствор и пропускали через бинарный сорбент — смесь 27,0 г активированного угля и 27,0 г вермикулита. Далее — по примеру 1. Содержание левомицетина составило 0,09105 мг/кг; степень извлечения — 91% (фиг.2).

Пример 3. Определение содержания левомицетина в маргарине жирностью 60,0% Количество внесенного антибиотика такое же, как в примере 2. Время экстракции ацетонитрилом — 4 часа. Бинарный сорбент — 40,5 г активированного угля и 45,5 г вермикулита. Содержание левомицетина составило 0,0891 мг/кг; степень извлечения — 89% (фиг.4).

Экспериментально установлено, что в зависимости от содержания жира в продукте время экстракции необходимо изменять. Для продуктов с содержанием жира от 1 до 10% оно составляет 2 часа, для продуктов с содержанием жира от 10 до 40% — 3 часа, выше 40% — 4 часа. Увеличение времени экстракции более 4 часов не приводит к увеличению степени извлечения антибиотика; при времени экстракции менее 2 часов экстракция левомицетина не является полной.

Заявляемый способ выделения, концентрирования и идентификации антибиотика левомицетина (хлорамфеникола) прост, не трудоемок, не требует большого количества реактивов и может быть применен в любой химической лаборатории, где имеется жидкостный хроматограф с УФ-детектором. Погрешность измерения составляет 3-4% для концентрации до 0,01 мг/кг и 10% для больших концентраций.

1. № М 01-28-2002. «Методика выполнения измерений массовой доли левомицетина (хлорамфеникола) в продуктах животного происхождения методом ОФ ВЭЖХ с фотометрическим детектированием с использованием жидкостного хроматографа «Люмахром»». — г.Санкт-Петербург: ООО «Люмэкс», 2008.

2. Концентрирование антибиотиков цефазолина, цефотаксима и левомицетина на модифицированных кремнеземах. / Л.И.Соколова, И.В.Чучалина. // Журнал аналитической химии. — 2006. — Т.61, №12, с.1238-1242.

3. Rupp. H.S. Liquid chromatography/tandem mass spectrometry analysis of chloramphenicol in cooked crabmeat / H.S.Rupp, J.S.Stuart, J.A.Hurlbut // Journal of AOAC International. — 2005. — Vol.88, N 4. — PP.1155-1159.

4. Определение бензилпенициллина, левомицетина и тетрациклина в пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. / Л.И.Соколова, А.П.Черняев. // Журнал аналитической химии. — 2001. — Т.56, №11, с.1177-1180.

1. Способ определения содержания левомицетина в пищевых продуктах, включающий экстракцию левомицетина из пробы ацетонитрилом, отделение от осадка раствора, содержащего левомицетин, очистку раствора сорбентом-вермикулитом при массовом соотношении 0,1 г сорбента на 1 г жира в пробе, доочистку раствора и концентрирование из него левомицетина при пропускании через сорбент в виде смеси активированного угля и вермикулита при их массовом соотношении 1:1, десорбцию левомицетина при элюировании этанолом, упаривание элюата с последующим растворением охлажденного остатка в подвижной фазе ацетонитрил-вода при их объемном соотношении 70:30, анализ полученного раствора методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии и расчет содержания левомицетина при помощи градуировочного графика.

2. Сорбент для осуществления способа по п.1, содержащий активированный уголь и вермикулит при их массовом соотношении, равном 1:1.

источник

ОТРАБОТКА УСЛОВИЙ ПРОБОПОДГОТОВКИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛЕВОМИЦЕТИНА В МЯСНЫХ ПРОДУКТАХ

Уланова Татьяна Сергеевна

д-р биол. наук, профессор, заведующий отделом химико-аналитических методов исследования ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения», РФ, г. Пермь

Карнажицкая Татьяна Дмитриевна

канд. биол. наук, заведующий лабораторией методов жидкостной хроматографии ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения», РФ, г. Пермь

Антипьева Марина Владимировна

канд. биол. наук, старший научный сотрудник лаборатории методов жидкостной хроматографии ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения», РФ, г. Пермь

Пшеничникова Екатерина Олеговна

химик лаборатории методов жидкостной хроматографии ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения», РФ, г. Пермь

ANALYSIS OF SAMPLE PREPARATION CONDITIONS FOR DETERMINATION OF CHLORAMPHENICOL IN MEAT PRODUCTS

Tatyana Ulanova

dr.Sci.Biol., professor, head of department of chemical analysis methods of Federal budget scientific institution “Federal scientific centre for medical and preventive health risk management technologies”, Russia Perm

Tatyana Karnazhitskaya

candidate of Biology, head of the laboratory of a liquid chromatography of Federal budget scientific institution “Federal scientific centre for medical and preventive health risk management technologies” Russia Perm

Marina Antipeva

candidate of Biology, senior research associate of laboratory of a liquid chromatography of Federal budget scientific institution “Federal scientific centre for medical and preventive health risk management technologies” Russia Perm

Ekaterina Pshenichnikova

chemist of laboratory of a liquid chromatography of Federal budget scientific institution “Federal scientific centre for medical and preventive health risk management technologies” Russia Perm

В статье представлены результаты исследований по выбору оптимальных условий пробоподготовки для определения левомицетина (хлорамфеникола) в мясе методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Изучена эффективность извлечения хлорамфеникола из мяса методами жидкостной и твердофазной экстракции. Установлено, что максимальная степень извлечения составляет 99,98 % и достигнута при использовании в качестве пробоподготовки жидкостной экстракции.

This article describes analysis results of sample preparation conditions for determination of chloramphenicol residue in meat by LC/MS/MS method. Efficiency of extraction of chloramphenicol from meat is studied by methods of liquid and solid-phase extraction. The maximum extent of extraction is about 99,98 %. It is reached by using liquid extraction for sample preparation.

Ключевые слова: хлорамфеникол; мясо; жидкостная экстракция; твердофазная экстракция; высокоэффективная жидкостная хроматография с масс-спектрометрическим детектированием.

Keywords: cloramphenicol; meat; liquid extraction; solid-phase extraction; liquid chromatography mass spectrometry.

Одной из задач современной аналитической химии является разработка селективных и высокочувствительных методик определения контаминантов в продуктах питания с целью оценки их влияния на здоровье населения. К числу загрязнителей пищевой продукции относятся ветеринарные препараты, в частности хлорамфеникол (левомицетин), представитель группы ароматических антибиотиков, широко используемый в ветеринарной практике для борьбы с инфекционными заболеваниями. Хлорамфеникол медленно выводится из организма животных и относительно долго сохраняет активность при хранении продуктов. При употреблении продуктов с остаточным содержанием хлорамфеникола в организме человека вырабатывается резистентность к антибиотику, может развиваться дисбактериоз, аллергические реакции, снижается иммунитет. В соответствии с СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов допустимый уровень остаточного содержания хлорамфеникола в продукции составляет 0,0003 мг/кг.

При разработке методики проведения анализа контаминантов в пищевых продуктах важное место занимает пробоподготовка, целью которой является наиболее полное извлечение следовых количеств аналита и эффективная очистка от компонентов биологической матрицы.

В статье представлены результаты исследований по выбору оптимальных условий пробоподготовки в ходе разработки методики определения левомицетина в мясных продуктах.

Экспериментальные исследования по отработке условий проводились на жидкостном хроматографе Agilent 1200 в сочетании с масс-спектрометрическим детектором с тройным квадруполем LC/MS 6460 Agilent Technologies в отработанных условиях выполнения анализа.

При выборе оптимальных условий подготовки проб к анализу для получения более точных результатов при проведении количественного анализа органических соединений необходимо учитывать влияние матричного эффекта, степень извлечения и погрешность подготовки проб к анализу, так как они могут в значительной степени повлиять на конечные результаты измерений [1]. С этой целью проведено сравнение эффективности экстракции антибиотика из образцов мясного фарша с использованием различных способов пробоподготовки.

В ходе проделанной работы был исследованы 2 варианта пробоподготовки с использованием метода твердофазной экстракции с насыпными сорбентами. Пробоподготовка основана на методе “QuEChERS”, используемом для определения пестицидов и других контаминантов в продуктах питания.

В первом варианте к 10 г мясного фарша, с заданным содержанием левомицетина, добавляли 20 см 3 ацетонитрила и соли, в основном MgSO₄ и NaCl, используемые в качестве высаливателей.

Смесь интенсивно встряхивали, центрифугировали при скорости вращения 3000 об/мин. Надосадочный слой отбирали в чистую пробирку объемом 50 см 3 и чистили путем добавления в пробирку с экстрактом сорбента и соли MgSO₄, интенсивно перемешивали в течение 1 минуты. Смесь центрифугировали в течение 1 мин со скоростью 3000 об/мин, верхний слой переносили в чистую пробирку, высушивали в токе воздуха при нагревании. Сухой остаток перерастворяли в 1 см 3 смеси ацетонитрил:вода (1:1), фильтровали через капроновый фильтр с диаметром пор 0,2 мкм и анализировали аликвоту объемом 10 мм 3 методом ВЭЖХ/МС.

Для расчета степени экстракции использовали характеристики, полученные для основного иона: площадь (S 321->152) и отношение сигнал/шум (SNR 321->152). Степень экстракции левомицетина составила 33 %.

В отличие от 1-го (безводного) варианта, исключающего присутствие воды, во 2-ом варианте экстракция протекала в водной среде. 2г мясного фарша, с заданным содержанием левомицетина, помещали в центрифужную пробирку вместимостью 50 см 3 , к образцу добавляли дистиллированную воду (8—10 см 3 ). Смесь интенсивно встряхивали в течение 1 минуты, добавляли 10 см 3 1 %-го раствора уксусной кислоты в ацетонитриле, интенсивно встряхивали в течение 5 минут, добавляли набор для ТФЭ с насыпным сорбентом для анализа мясных и молочных продуктов, встряхивали в течение 1 минуты и центрифугировали при скорости вращения 4000 об/мин. Надосадочный слой отбирали в чистую пробирку объемом 15 см 3 , содержащую сорбент для очистки экстракта, интенсивно встряхивали в течение 2 минут, центрифугировали при скорости вращения 4000 об/мин. Верхний слой растворителя переносили в новую пробирку, высушивали в токе воздуха при температуре 40 о С, перерастворяли в 0,8 см 3 раствора метанол/вода/0,1 % уксусная кислота. Экстракт фильтровали через капроновый фильтр и анализировали в количестве 10 мм 3 методом ВЭЖХ/МС. Степень экстракции хлорамфеникола из образцов мяса составляет 41,0 %.

Наиболее широко используемым приемом извлечения анализируемых веществ из биологических сред, в том числе продуктов питания, является экстракция [2]. Изучена эффективность извлечения левомицетина из мяса методом жидкостной экстракции с использованием в качестве экстрагента этилацетата. Процедура пробоподготовки заключалась в двойной экстракции 10 г мясного фарша, с заданным содержанием левомицетина, этилацетатом. Объединенные экстракты высушивали в токе воздуха на водяной бане до образования остатка в виде маслянистой капли. К остатку добавляли 2 см 3 метанола, 25 см 3 4 %-ного водного раствора хлорида натрия и 20 см 3 гексана. Содержимое пробирки интенсивно встряхивали и центрифугировали в течение 5 мин со скоростью 3000 об/мин. Верхний (гексановый) слой отбрасывали и проводили повторную очистку гексаном. К оставшемуся раствору добавляли 15 см 3 этилацетата, тщательно перемешивали, центрифугировали со скоростью 3000 об/мин. Верхний слой (слой этилацетата) переносили в чистую пробирку, проводили повторную жидкостную экстракцию этилацетатом. Объединенный экстракт высушивали досуха на водяной бане при температуре 45 о С. Остаток растворяли в 1 см 3 смеси метанол:вода=1:1, фильтровали через капроновый фильтр и анализировали аликвоту объемом 10 мм 3 методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ/МС).

Степень экстракции левомицетина составила 99,98 %. Результаты анализа представлены в таблице 2.

С целью сравнения эффективности извлечения хлорамфеникола из мясных продуктов различными способами дополнительно проведены исследования по определению хлорамфеникола из продуктов животного происхождения согласно действующим методическим указаниям МУК 4.1.1912-04 «Определение остаточных количеств левомицетина (хлорамфеникола, хлормицетина) в продуктах животного происхождения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и иммуноферментного анализа».

10 г мясного фарша, с заданным содержанием левомицетина, гомогенизировали с 15см 3 фосфатного буфера (0,025 М КН₂Р0₄ + 0,025 М Na₂НР0₄) рН = 6,88 и экстрагировали 3 раза по 30 см 3 этилацетата. Полученную взвесь центрифугировали 15 мин при 4000 об./мин и декантировали этилацетатный слой, промывали последовательно 5 см 3 насыщенного раствора NaС1 с добавлением 0,2 мл 10 %-ного NaОН; 5 мл насыщенного раствора NaС1 с добавлением 0,2 мл 10 %-ного СН₃СООН и 5 см 3 насыщенного раствора NaС1. Органический слой отбирали и упаривали на ротационном испарителе (при 50 °С) до возможно минимального объема, отдували азотом до исчезновения запаха органических растворителей, добавляли 3 см 3 смеси ацетонитрил:вода (1:4) и экстрагировали 3 раза 5 см 3 петролейного эфира, петролейный эфир отбрасывали и извлекали хлорамфеникол экстракцией этилацетатом (3 раза по 5 см 3 ). Этилацетатный слой упаривали досуха, растворяли в 0,1 см 3 метанола и анализировали аликвотное количество раствора. Степень экстракции хлорамфеникола из образцов мяса составила 56,4 %.

Результаты исследований по определению эффективности извлечения хлорамфеникола методом жидкостной экстракции, твердофазной экстракции с насыпным сорбентом и по методическим указаниям МУК 4.1.1912-04 приведены в таблице 2.

Сравнение эффективности способов извлечения хлорамфеникола из мясной матрицы

Способ пробоподготовки

Степень извлечения с учетом матричного эффекта, %

источник