Меню Рубрики

Среда сабуро с левомицетином

При составлении питательных сред для микроорганизмов необходимо учитывать их потребность в элементах питания. По составу питательные среды подразделяются на две группы: естественные (натуральные) и синтетические.

Естественными обычно называют среды, которые состоят из продуктов животного или растительного происхождения, имеющих сложный неопределенный химический состав.

На естественных средах хорошо развиваются многие микроорганизмы, так как в этих средах имеются, обычно, все компоненты, необходимые для роста и развития. Однако среды с неопределенным составом малопригодны для изучения физиологии обмена веществ микроорганизмов, поскольку они не позволяют учесть потребление ряда компонентов среды, а с другой стороны, выяснить, какие вещества образуются по ходу развития микроорганизмов. Это связано с тем, что состав естественных сред очень сложен; кроме того, он не является постоянным, так как существенно колеблется в зависимости от сырья и способа приготовления сред. Это заметно влияет на рост микроорганизмов. Естественные среды неопределенного состава используются главным образом для поддержания культур микроорганизмов, накопления их биомассы и для диагностических целей.

Для грибов, наиболее широко используют полноценные среды, приготовленные на основе солодового сусла. В состав сусла входят глюкоза, фруктоза, сахароза, мальтоза, мальтотриоза, небольшое количество пентоз – арабиноза, ксилоза, рибоза. Эти вещества и являются основными источниками углерода и энергии для грибов. В сусле имеются также аминокислоты, витамины и минеральные вещества. Для культивирования грибов в питательных средах обычно устанавливают рН 5–6, поскольку грибы в большинстве своем являются ацидофильными микроорганизмами.

Синтетические среды − это такие среды, в состав которых входят только определенные, химически чистые соединения, взятые в точно указанных концентрациях. Синтетические среды следует готовить на дистиллированной воде. Для разработки синтетических сред, обеспечивающих нормальный рост изучаемого микроорганизма или максимальный биосинтез какого-либо продукта его жизнедеятельности, необходимо знать особенности обмена веществ данного организма и его потребности в источниках питания. В настоящее время в распоряжении микробиологов имеется достаточное количество синтетических сред, не уступающих по своим качествам сложным средам неизвестного состава. Синтетические среды могут иметь относительно большой набор компонентов, но могут быть и довольно простыми по составу. Синтетические среды наиболее удобны для исследования обмена веществ микроорганизмов. Зная точный состав и количество входящих в среду компонентов, можно изучить их потребление и превращение в соответствующие продукты обмена.

Для курсового проекта были использованы следующие питательные среды:

— питательный агар (ПА) готовят из коммерческого препарата «Питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой», который содержит панкреатический гидролизат кильки, хлорид натрия и агар-агар. Обычно для приготовления плотной среды требуется вносить в среду дополнительное количество агар-агар. Поскольку эта среда содержит агар-агар, который растворяется в воде только при температуре 98 о С, навески порошка вносят во флаконы, заливают нужным объемом воды и стерилизуют автоклавированием при 1 ати 20-30 мин;

— сусло-агар (СА). Поскольку основой служит сусло-бульон с кислой среды, для получения плотных агаризованных сред берут небольшой избыток агар-агар в расчете на то, что в процессе стерилизации часть его подвергнется температурно-кислотному гидролизу. Во флаконы с сусло-бульоном вносят агар-агар до концентрации 2–2,5% для плотной среды и 1,0-1,5% для полужидкой. Стерилизуют при 0,5 ати 30 мин.

— питательный бульон (ПБ) готовят из коммерческого препарата «Питательный бульон для культивирования микроорганизмов сухой», который содержит панкреатический гидролизат кильки и рыбной муки и хлорид натрия. Растворяют навеску порошка в воде в пропорции, обозначенной на этикетке. Контролируют рН, разливают по флаконам и стерилизуют автоклавированием при 1 ати 20-30 мин;

— питательный агар для грибов (агар Чапека)

Для приготовления агара Чапека берут 20−30 г агар-агара, заливают его 1000 мл дистиллированной воды и вымачивают в течение 2 ч при комнатной температуре. Воду сливают и измеряют ее объем для определения количества воды, впитавшейся агаром. Затем агар промывают 2−3 раза дистиллированной водой.

Взвешивают остальные компоненты среды (сахароза − 30,0 г, азотнокислый натрий −3,0 г, фосфорнокислый однозамещенный калий −1,0 г, сернокислый магний − 0,5 г, хлористый калий − 0,5 г, сернокислое закисное железо−0,01 г) и растворяют в дистиллированной воде, которую берут в объеме, равном количеству воды, слитой при вымачивании агара. К раствору добавляют отмытый агар, после чего среду варят в автоклаве текучим паром в течение часа.

Полученную среду фильтруют, разливают по пробиркам или колбам и стерилизуют в автоклаве при температуре 110−112°С (под давлением 0,05 МПа по показанию манометра) в течение 20 мин.

Для ее приготовлении к 100 см 3 дистиллированной воды добавляют 1,8 г агара и оставляют на 30 мин для его набухания, затем добавляют 4 г мальтозы или глюкозы и 1 г пептона, нагревают до полного растворения (при наличии осадка фильтруют). Стерилизуют среду при температуре 115 0 С в течение 15 минут.

Для повышения селективности, т.е. подавления развития посторонних микроорганизмов, в среду Сабуро добавляют растворы антибиотиков – пенициллина (50 ЕД/см 3 ), левомицетина (10 мкг/см 3 ). [6]

Кроме того, в курсовом проекте был использован физиологический раствор (ФР). Для его приготовления 8,5 г хлористого натрия растворяют в 1 л дистиллированной воды. Стерилизуют при 0,15 МПа в течение 20 минут [19].

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: Как то на паре, один преподаватель сказал, когда лекция заканчивалась — это был конец пары: «Что-то тут концом пахнет». 8181 — | 7871 — или читать все.

195.133.146.119 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.

Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)

очень нужно

источник

Цена за упаковку 250 г.

Инструкция по применению набора реагентов «Питательная среда для контроля микробной загрязненности сухая — М (Сабуро-агар)»

1.1.Набор реагентов предназначен для культивирования грибов, а также определения общего числа грибов в нестерильных лекарственных средствах.

1.2.Выпускается в полиэтиленовых банках по 250 г.

  1. ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА

Принцип метода – визуальное обнаружение грибов, выросших на питательной среде при посеве исследуемых образцов.

Набор реагентов представляет собой смесь сухих компонентов

-пептон сухой ферментативный для бактериологических целей 12,0

-экстракт кормовых дрожжей агаризованный 5,0

-агар микробиологический ( 9,0±0,2 )

3.АНАЛИТИЧЕСКАЯ И ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ

3.1Специфическая активность (показатели чувствительности, скорость роста и стабильность основных биологических свойств микроорганизмов). Набор реагентов должен обеспечивает рост тест-штаммов Candida albicans 259/NCТC/885/653, Candida brumptii 530/ИБФМ-J-40 и Aspergillius niger ВКМ F-1119 при посеве по 0,1 мл взвеси каждого тест-штамма из разведений 10 -4 и 10 -5 через (24±1) ч инкубации при температуре (37±1) °С для С.albicans 259/NCT/885/653, через (24±1) ч инкубации при температуре (28±1)ºС для C. brumptii 530/ИБФМ-J-40 и через 48-72 ч инкубации при температуре (22.5±2.5)ºС для Aspergillius niger ВКМ F-1119.

Тест-штамм C.albicans 259/NCТC/885/653 растет в виде плотных колоний с ровными краями, белого цвета, выпуклых, блестящих, диаметром 1,0-2,0 мм, тест-штамм C.brumptii 530/ИБФМ-J-40 – в виде плотных колоний с ровными краями кремового цвета, плоских, с неровной поверхностью, диаметром 1,0-3,0 мм, Aspergillius niger ВКМ F-1119 – в виде пушистого мицелия, белого или светло-желтого цвета, а на 4-7 сутки темно-коричневого или черного.

Соблюдение «Правил устройства, техники безопасности производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения» (Москва, 1981 г.).

5.ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ

  • Термостат, обеспечивающий температуру (37±1) °С;
  • Автоклав;
  • Пробирки стеклянные;
  • Пипетки стеклянные;
  • Чашки Петри;
  • Вода дистиллированная;
  • 0,9 % раствор натрия хлорида;
  • Бутылки стеклянные;
  • Вата медицинская гигроскопическая.

Объекты исследований в санитарной и клинической микробиологии.

  1. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА

7.1. Приготовление рабочего раствора реагента

Набор реагентов в количестве, указанном на этикетке, размешивают в 1 л дистиллированной воды, доводят до кипения, кипятят 1-2 мин, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, стерилизуют автоклавированием при температуре (121±1) °С в течение 15 мин. Среду охлаждают до температуры (45±5) °С и разливают в стерильные чашки Петри слоем 3-5 мм. После застудневания чашки со средой подсушивают в термостате при температуре (37±1) °С в течение 40 мин.

Готовая среда желтого цвета. Готовую среду можно использовать в течение 7 суток при условии хранения ее при температуре от 2 до 8 °С

7.2 Посев исследуемого материала

Посев исследуемого материала проводить согласно ФС 42-1846-88 «Испытание лекарственных средств на микробиологическую чистоту» и приказом Минздрава СССР от 22.04.85 № 535 «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследований, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений».

Регистрацию результатов анализа проводят визуально, по наличию роста колоний.

Учет результатов производят согласно ФС 42-1846-88 «Испытание лекарственных средств на микробиологическую чистоту» и приказом Минздрава СССР от 22.04.85 № 535 «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследований, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений»

10.УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИЯ НАБОРА

Набор реагентов хранить в герметично закрытой упаковке в сухом месте при температуре от 2 до 25 ºС.

Набор реагентов транспортируют при температуре от 2 до 25 ºС всеми видами крытого транспорта.

Срок годности – 2 года со дня изготовления. Набор реагентов с истекшим сроком годности использованию не подлежит.

Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение настоящей Инструкции по применению.

Рекламации на качество набора реагентов Питательная среда для контроля микробной загрязненности сухая – М (агар Сабуро) в течение срока годности следует направлять в адрес производителя: ФГУП «НПО «Микроген», Россия, 115088, г. Москва, ул. 1-ая Дубровская , д.15 тел.(495) 710-37-87. Адрес производства: 367010, г. Махачкала, ул.А.Султана 13 «б» тел 8722 55-82-32

источник

МОЛОКО И МОЛОЧНАЯ ПРОДУКЦИЯ

Определение дрожжей и плесневых грибов

Milk and dairy products. Determination of yeast and mould

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным научным учреждением «Всероссийский научно-исследовательский институт маслоделия и сыроделия» (ФГБНУ «ВНИИМС») и Федеральным государственным бюджетным научным учреждением «Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности» (ФГБНУ «ВНИМИ»)

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстандарт)

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 12 ноября 2015 г. N 82-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97

Сокращенное наименование национального органа по стандартизации

Минэкономики Республики Армения

Госстандарт Республики Казахстан

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 8 декабря 2015 г. N 2116-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 33566-2015 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2016 г.

5 ВВЕДЕН ВЗАМЕН ГОСТ 10444.12-2013 в части молока и молочной продукции

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

Настоящий стандарт распространяется на молоко и молочную продукцию и устанавливает метод определения дрожжей и плесневых грибов.

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты
________________
В Российской Федерации действует ГОСТ Р 12.1.019-2009 «Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты».

ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 12.4.021-75 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования

ГОСТ OIML R 76-1-2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 490-2006 Кислота молочная пищевая. Технические условия

ГОСТ 975-88 Глюкоза кристаллическая гидратная. Технические условия

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 5556-81 Вата медицинская гигроскопическая. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ ISO 7218-2011 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям

ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ ISO 11133-1-2011 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания по приготовлению и производству культуральных сред. Часть 1. Общие руководящие указания по обеспечению качества приготовления культуральных сред в лаборатории

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 13805-76 Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей. Технические условия

ГОСТ 13928-84 Молоко и сливки заготовляемые. Правила приемки, методы отбора проб и подготовка их к анализу

ГОСТ 17206-96 Агар микробиологический. Технические условия

ГОСТ 19881-74 Анализаторы потенциометрические для контроля pH молока и молочных продуктов. Общие технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 25706-83 Лупы. Типы, основные параметры. Общие технические требования

ГОСТ 26809.1-2014 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу. Часть 1. Молоко, молочные и молочные составные, молокосодержащие продукты

ГОСТ 26809.2-2014 Молоко и молочная продукция. Правила приемки, отбор проб и подготовка их к анализу. Часть 2. Масло из коровьего молока, спреды, сыры и сырные продукты, плавленые сыры и плавленые сырные продукты

ГОСТ 27752-88 Часы электронно-механические кварцевые настольные, настенные и часы-будильники. Общие технические условия

ГОСТ 28498-90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний.

ГОСТ 29169-91 (ИСО 648-77) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ 32901-2014 Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа

ГОСТ 33567-2015 Сахар молочный. Технические условия

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

Читайте также:  Побочные эффекты левомицетина глазных капель

В настоящем стандарте применены термины в соответствии с [1], а также следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 дрожжи: Гетерогенная группа одноклеточных эукариотических грибов, не имеющих мицелия или реже образующих псевдомицелий и существующих в виде отдельных клеток, для которых типичным способом размножения является почкование.

3.2 плесневые грибы: Микроскопические эукариотические многоклеточные организмы, образующие вегетативные нити — гифы без перегородок или септированные на клетки. Гифы объединяются в мицелий — «вегетативное» тело гриба. На поверхности находятся органы размножения, содержащие огромное количество спор круглой или овальной формы. Диаметр гиф — от 5 до 50 мкм. Клетки имеют четко дифференцированное ядро.

4.1 Отбор проб — по ГОСТ 32901. Правила приемки и общие правила отбора проб — по ГОСТ 13928, ГОСТ 26809.1, ГОСТ 26809.2.

Пробы для микробиологических испытаний от продукции, попавшей в выборку, отбирают до отбора проб, предназначенных для органолептических и физико-химических анализов.

Отбор проб проводят в стерильную посуду достаточной вместимости и удобной формы (стеклянные колбы, банки, чашки Петри и т.д.), закрывают стерильными пробками или крышками, которые закрывают стерильной бумагой и обвязывают.

Отбор проб проводят с соблюдением вышеуказанных правил из точек, определенных программой производственного контроля, и в соответствии со схемами микробиологического контроля производства молочной продукции.

5.1 Сущность метода

Метод основан на способности дрожжей и плесневых грибов, содержащихся в молоке и молочной продукции, независимо от их видовой и групповой принадлежности, при посеве продукта либо его разведений на плотную питательную среду образовывать видимые характерные колонии через 3-5 сут при температуре (24±1)°С или (30±1)°С.

5.2 Средства измерения, вспомогательное оборудование, материалы, посуда и реактивы

Анализаторы потенциометрические по ГОСТ 19881, типа I, с пределами допускаемого значения основной абсолютной погрешности преобразователя ±0,02 ед. pH.

Весы неавтоматического действия по ГОСТ OIML R 76-1 с пределами допускаемой абсолютной погрешности ±0,001 г; ±0,01 г и ±0,1 г.

Стерилизатор паровой медицинский (автоклав).

Баня водяная с обогревом, позволяющая поддерживать температуру от 0°С до 100°С, погрешностью ±2°С.

Термостат жидкостный, позволяющий поддерживать температуру от 15°С до 55°С, погрешностью ±1°С.

Термостат суховоздушный с естественной или принудительной циркуляцией воздуха или без нее, с охлаждением.

Термометр стеклянный жидкостный (не ртутный) по ГОСТ 28498, диапазоном измерения от 0°С до 100°С и ценой деления шкалы 1°С.

Часы по ГОСТ 27752 или таймер.

Лупа по ГОСТ 25706, с кратностью увеличения от 4 до 10.

Вата медицинская гигроскопическая по ГОСТ 5556.

Бумага индикаторная универсальная.

Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.

Пипетки 1-1(2)-1 по ГОСТ 29169.

Пипетки 1-1(2)-1(2)-1(2, 5, 10) по ГОСТ 29227.

Колбы мерные 2-50(100, 200, 500, 1000)-2 по ГОСТ 1770.

Колбы конические Кн-2-100(250)-34 ТХС по ГОСТ 25336.

Цилиндры 1(2)-50(100)-1 по ГОСТ 1770.

Пробирки П1, П2-16-150 ТС по ГОСТ 25336.

Пробирки П1, П2-21-200 ТС по ГОСТ 25336.

Чашки Петри ЧБН-1-100 или ЧБН-2 по ГОСТ 25336.

Стекла предметные для микропрепаратов по ГОСТ 9284.

Агар микробиологический по ГОСТ 17206.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, растворы массовой концентрации 5 г/дм , массовой долей от 20% до 30%, молярной концентрации 0,1 моль/дм .

Кислота молочная по ГОСТ 490, раствор объемной долей 20%.

Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей по ГОСТ 13805.

Глюкоза кристаллическая гидратная по ГОСТ 975.

Гидролизат молочных белков сухой «Лактопептон», массовой долей общего азота не менее 10,0%, массовой долей аминного азота не менее 4,0% и массовой долей лактозы не более 7,0%.

Сыворотка молочная сухая.

Лактоза или сахар молочный рафинированный мелкокристаллический по ГОСТ 33567.

Ингибиторозащищенные пенициллины (ампициллин натрия, ампиокс натрия, амоксициллин), массовой долей основного вещества не менее 98%.

Неомицина сульфат, массовой долей основного вещества не менее 98%.

Тетрациклины (тетрациклин гидрохлорид, окситетрациклин гидрохлорид), массовой долей основного вещества не менее 98%.

Хлорамфеникол (левомицетин сукцинат), массовой долей основного вещества не менее 98%.

Фторхинолон (левофлоксацин), массовой долей основного вещества не менее 98%.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Среда Сабуро, плотная питательная среда основного характера, предназначенная, при добавлении антибиотиков, для выявления и определения дрожжей и плесневых грибов в молоке и молочной продукции, а без добавления антибиотиков — для контроля консервов на промышленную стерильность.

Среда агаровая для определения дрожжей и плесневых грибов, плотная элективная питательная среда, предназначенная для выявления и определения дрожжей и плесневых грибов в молоке и молочной продукции.

Допускается применение других средств измерения, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающих необходимую точность измерения, а также реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.

Общие положения по обеспечению качества приготовления питательных сред в соответствии с ГОСТ ISO 11133-1.

5.3.1 Приготовление питательной среды Сабуро

70,0 г сухой среды, состоящей из 40,0 г глюкозы, 12,0 г пептона или сухого гидролизата молочных белков, 18,0 г микробиологического агара, вносят в 1 дм дистиллированной воды и оставляют на 30 мин для набухания. Среду при помешивании нагревают до полного расплавления агара, не допуская пригорания. В полученной среде проверяют активную кислотность и, при необходимости, корректируют ее раствором гидроокиси натрия массовой долей от 20% до 30% или раствором молочной кислоты объемной долей 20% до значения активной кислотности (5,8±0,1) ед. pH, разливают в колбы и стерилизуют при температуре 112°С и давлении 0,5 атм в течение 30 мин или при температуре (121±1)°С в течение 15 мин.

5.3.2 Приготовление агаровой среды для определения дрожжей и плесневых грибов

60,0 г сухой агаровой среды для определения дрожжей и плесневых грибов, состоящей из 18,0 г сухой осветленной молочной сыворотки, 18,0 г лактозы и 24,0 г микробиологического агара, вносят в 1 дм дистиллированной воды, нагревают до полного растворения, при наличии осадка фильтруют. В полученной среде проверяют активную кислотность и, при необходимости, корректируют ее раствором гидроокиси натрия массовой долей от 20% до 30% или раствором молочной кислоты объемной долей 20% до значения активной кислотности 4,6-4,7 ед. pH, разливают в пробирки или колбы и стерилизуют 15 мин при температуре 121°С.

5.3.3 Приготовление растворов антибиотиков

5.3.3.1 Для повышения селективности питательных сред при выявлении и определении дрожжей и плесневых грибов используются антибиотики, подавляющие развитие бактерий при посеве молочных продуктов, содержащих смешанную микрофлору.

При выборе антибиотиков исходят из следующих положений:

— антибиотик должен обладать максимально широким спектром действия относительно всех групп бактерий и не оказывать влияния на развитие дрожжей и плесневых грибов в используемых концентрациях;

— быть полностью растворимым в воде;

— по возможности обладать термо- и кислотоустойчивостью;

— быть доступным для приобретения в аптечной сети.

5.3.3.2 Приготовление растворов антибиотиков группы ингибиторозащищенных пенициллинов

Во флакон с ампициллином натрия или ампиоксом натрия, содержащим 0,5 г препарата, добавляют от 2,0 до 5,0 см стерильной дистиллированной воды, тщательно перемешивают для растворения. Содержимое флакона переносят в стерильную мерную колбу вместимостью 100 см и доводят до метки стерильной дистиллированной водой температурой от 35°С до 40°С.

При использовании препарата амоксициллина содержимое капсулы 0,5 г вносят в стерильную мерную колбу вместимостью 100 см , добавляют от 10 до 20 см стерильной дистиллированной воды температурой от 35°С до 40°С, перемешивают до растворения, затем доливают стерильной дистиллированной водой до метки.

Получают растворы массовой концентрации 5 мг/см ампициллина натрия, ампиокса натрия или амоксициллина. При использовании ампициллина натрия, ампиокса натрия или амоксициллина с другим содержанием основного вещества делают соответствующий пересчет.

5.3.3.3 Приготовление растворов антибиотиков группы левомицетинов

Во флакон с сукцинатом левомицетина, содержащим 0,5 г препарата, добавляют от 2,0 до 5,0 см стерильной дистиллированной воды, тщательно перемешивают для растворения. Содержимое флакона переносят в стерильную мерную колбу вместимостью 100 см и доводят до метки стерильной дистиллированной водой температурой от 35°С до 40°С.

Получают раствор сукцината левомицетина массовой концентрации 5 мг/см препарата. При использовании сукцината левомицетина с другим содержанием основного вещества делают соответствующий пересчет.

5.3.3.4 Приготовление растворов антибиотиков группы фторхинолонов

Флакон со 100 см раствора левофлоксацина для инфузий массовой концентрации 5 мг/см открывают перед непосредственным использованием.

5.3.3.5 При использовании сульфата неомицина содержимое флакона в количестве 0,5 г вносят в стерильную мерную колбу вместимостью 50 см , добавляют от 10 до 20 см стерильной дистиллированной воды температурой от 35°С до 40°С, перемешивают до растворения, затем доливают стерильной дистиллированной водой до метки.

Массовая концентрация сульфата неомицина — 10 мг/см . При использовании сульфата неомицина с другим содержанием основного вещества делают соответствующий пересчет.

5.3.3.6 Приготовление растворов антибиотиков группы тетрациклинов

Во флакон с гидрохлоридом тетрациклина или гидрохлоридом окситетрациклина, содержащим 1,0 г препарата, добавляют от 2,0 до 5,0 см стерильной дистиллированной воды, тщательно перемешивают для растворения. Содержимое флакона переносят в стерильную мерную колбу вместимостью 100 см и доводят до метки стерильной дистиллированной водой температурой от 35°С до 40°С.

Получают растворы гидрохлорида тетрациклина или гидрохлорида окситетрациклина массовой концентрации 10 мг/см препаратов. При использовании гидрохлорида тетрациклина или гидрохлорида окситетрациклина с другим содержанием основного вещества делают соответствующий пересчет.

5.3.4 Использование растворов антибиотиков

5.3.4.1 Растворы антибиотиков заданной массовой концентрации готовят непосредственно перед использованием.

Растворы антибиотиков добавляют к питательным средам, подготовленным по 5.3.1 и 5.3.2, как до стерилизации, так и к расплавленным и охлажденным до температуры (46±1)°С питательным средам после их стерилизации.

Раствор антибиотика окситетрациклина следует вносить только после стерилизации питательных сред.

Раствор антибиотика левомицетина следует вносить только перед стерилизацией питательных сред.

5.3.4.2 Определение дрожжей и плесневых грибов в молоке и молочной продукции на среде Сабуро проводят с обязательным использованием антибиотиков.

5.3.4.3 Определение дрожжей и плесневых грибов в молоке и молочной продукции на агаровой среде для определения дрожжей и плесневых грибов проводят с использованием антибиотиков.

Допускается определение дрожжей и плесневых грибов в молоке и молочной продукции на агаровой среде для определения дрожжей и плесневых грибов без использования антибиотиков. При этом предусматривается обязательная визуальная оценка выросших на чашке колоний и, в случае сомнения, микроскопирование.

Растворы антибиотиков добавляют к питательным средам согласно таблице 1.

Таблица 1 — Перечень антибиотических препаратов, рекомендуемая доза рабочего раствора, объем ее внесения в питательную среду и конечная концентрация антибиотика в среде

источник

Здравствуйте, участники группы!

Филиал «Медгамал» Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи Российской академии медицинских наук ПРОИЗВОДИТ И РЕАЛИЗУЕТ ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

Бульон Хоттингера
Бульон Сабуро (Среда Сабуро жидкая)
Бульон бычьего сердца
Бульон Хоттингера с мясным экстрактом
Бульон мясо-пептонный
Бульон сахарный
Бульон солевой
Бульон Мартена
Бульон мясо-пептонный с глюкозой
Бульон казеиновый
Бульон скарлатинозный
Среда казеиново-растительная стафилококковая
Среда тиогликолевая
Среда Блаурокка
Среда Конникова
Среда МРС (жидкая)
Среда для уреаплазм
Клостридиальный бульон
Среда Гисса (сахара)
Среда №3
Среда №8
Среда Китт-Тароцци с печенью
Среда Китт-Тароцци с печенью полужидкая
Среда Китт-Тароцци с мясом
Раствор для разведения культуры
Питательный желатин
Среда сахарозо-желатиновая
Фосфорно-желатиновый буфер
Буфер №2 с содой
Фосфатный буфер
Пептонная вода 1%
Пептонная вода 5%
Пептонная вода 10%
Основной раствор пептона
Глюкоза 40%
Глюкоза 50%
0,9% раствор хлорида натрия (физиологический раствор)
Дистиллированная вода
Гель алюминия гидроксида

ПЛОТНЫЕ И ПОЛУЖИДКИЕ
ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

Агар Хоттингера
Агар Сабуро (Среда №2)
Агар бычьего сердца (Среда Каган плотная)
Агар бычьего сердца полужидкий
Агар Сабуро с левомицетином
Агар Сабуро с гентамицином
Агар Хоттингера щелочной для выращивания холерного вибриона
Агар казеиново-угольный
Агар (на физрастворе) голодный
Агар Хоттингера с мясным экстрактом
Агар мясо-пептонный
Агар Хоттингера полужидкий
Агар солевой
Агар мясо-пептонный с глюкозой
Среда №1
Среда Коростелёва
Агар питательный
Агар Мартена
Агар сахарный
Среда Борде-Жангу
Среда МРС (плотная)
Среда МРС (полужидкая)
Среда Вильсона-Блера
Среда Хинтона-Мюллера
Среда Романова
Среда Ресселя
Среда Клиглера
Среда Пизу (основа)
Среда для получения спор
Среда №3* для определения остаточных количеств антибиотиков в пищевых продуктах
Среда №5* для определения остаточных количеств антибиотиков в пищевых продуктах
Среда №7* для определения остаточных количеств антибиотиков в пищевых продуктах
Среда №9
Среда №10
Среда №11
Агар на пивном сусле
Среда с дрожжевым экстрактом
Агар голодный пшеничный
Кукурузный агар

Мясной экстракт (мясная вода)
Гидролизат Хоттингера
Гидролизат казеина глубокой степени расщепления (для коклюшной среды)
Гидролизат казеина средней степени расщепления
Гидролизат бычьего сердца
Гидролизат казеина панкреатический (для тиогликолевой среды)
Индикатор Андреде
Спиртовая эмульсия панкреатина
Экстракт пшеничных отрубей
Дрожжевой экстракт 10%
Дрожжевой экстрат 25%
Дрожжевой экстракт 100%
Дрожжевой диализат
Печеночный отвар
Печень отработанная стерильная
Мясо отработанное стерильное
Пептон Мартена
Пептон ПОПЭ (классический)

Хотелось бы узнать, какие среды наиболее востребованы в вашем обществе и почему? Какие трудности возникают при необходимости приобретения данной продукции? Если возникнут какие-либо вопросы по данной теме, пожалуйста, обращайтесь. Постараюсь помочь и максимально разъяснить.

источник

Владельцы патента RU 2275631:

Изобретение относится к медицинской микологии и клинической микробиологии. Диагностику дерматомикозов осуществляют путем высева дерматофитов из клинического материала на плотную селективную среду Сабуро с добавлением антибиотика — левомицетина и гидролизата кератина, полученного из куриного пера. Питательная среда для выделения дерматофитов имеет следующий состав, г/л: глюкоза — 40,0; пептон — 10,0; агар — 18,0-20,0; гидролизат кератина (в пересчете на сухое вещество) — 10,0-20,0; левомицетин — 50000 ЕД; дистиллированная вода — остальное. Посев инкубируют при температуре 22-24°С в течение 4-8 дней с последующей идентификацией вида колоний. Способ наиболее эффективен при выделении из материала от больных культур грибов-дерматофитов, в частности Microsporum canis, Trichophyton vermcosum, Trichophyton mentagrophytes var. gypseum, Trichophyton rubrum. Использование питательной среды с гидролизатом кератина позволяет сократить сроки выделения и идентификации культур грибов-дерматофитов из клинического материала. 2 н.п. ф-лы, 5 табл.

Изобретение относится к медицинской микологии и клинической микробиологии, наиболее эффективно может быть использовано при выделении культур грибов-дерматофитов, например Microsporum canis, Trichophyton verrucosum, Trichophyton mentagrophytes var. gypseum, Trichophyton rubrum, из материала от больных.

Диагностика дерматомикозов проводится с помощью микроскопии и по результатам посевов материала от больного на различные питательные среды. Однако не при всех случаях, даже при соблюдении всех правил забора материала, удается идентифицировать возбудителя [1].

Известен способ выделения дерматофитов, который предусматривает посев материала на поверхность плотной среды Сабуро следующего состава, г/л:

Глюкоза или мальтоза — 40,0;

Читайте также:  Плавниковая гниль у гуппи левомицетином

Дистиллированная вода — остальное.

Инкубация посевов проводится при температуре 28-30°С в течение 30 дней [2].

Недостатком этого способа является то, что используемая питательная среда не подавляет рост сопутствующей микрофлоры, что затрудняет идентификацию дерматофитов.

Известен способ выделения дерматофитов на плотной среде Сабуро с селективными добавками — пенициллин (20000 ЕД) или стрептомицин (40000 ЕД), гентамицин (0,005 г/л), левомицетин (016 г/л):

Глюкоза или мальтоза — 40,0;

Дистиллированная вода — остальное.

Инкубация посевов проводится при температуре 28-30°С в течение 30 дней [2].

Антибиотики вносят в среду для подавления роста сопутствующей микрофлоры и устранения таким образом ее антагонистического действия на дерматофиты. Недостатком этого способа является длительность процесса выделения чистой культуры [3].

В патенте [4] описан способ выделения грибов родов Microsporum и Trichophyton из клинического материала на селективной среде Сабуро с добавлением жидкой медицинской желчи, дрожжевого аутолизата и антибиотика из группы фторхинолонов, например ципрофлоксацина, при следующем соотношении компонентов, г/л:

Жидкая медицинская желчь — 1,0;

Аутолизат дрожжевой концентрированный — 5,0;

Дистиллированная вода — до 1,0 л.

Посев инкубируют при температуре 37°С 5-7 дней и 15 дней при температуре 28-30°С с последующей идентификацией вида колоний.

В патенте [5] описан способ получения хитина и хитозана путем культивирования дерматофитов в жидкой среде, содержащий кератин. Однако доступность нерастворимого в воде кератина недостаточна в случае использования плотных питательных сред. К тому же содержащаяся в среде Сабуро глюкоза тормозит активность кератиназы — фермента, необходимого для усвоения кератина, кроме того, секреция фермента достигает максимальной величины только к 15 суткам инкубации [6].

Наиболее близким к заявляемому способу идентификации дерматофитов, с учетом состава и типа среды для их культивирования, является способ высева материала на плотную среду Сабуро с антибиотиками [2].

Целью изобретения является сокращение сроков выделения культуры грибов-дерматофитов из материала от больного, а также увеличение надежности идентификации дерматофитов.

Изобретение заключается в том, что питательная среда, содержащая глюкозу и микробиологический агар (среда Сабуро), дополнительно содержит гидролизат кератина определенного состава (см. пример 1) при следующих соотношениях ингредиентов, г/л:

Гидролизат кератина (в пересчете на сухое вещество) — 10,0-20,0;

Дистиллированная вода — остальное.

Питательную среду готовили следующим образом:

в колбу насыпали 18,0-20,0 г мелко размельченного агара, доливали 900 мл дистиллированной воды и через 30 мин прибавляли 40,0 г глюкозы и 10,0 г пептона, после чего кипятили в течение 30 мин и фильтровали. Затем добавляли 40,0-80,0 мл 25% гидролизата кератина, доливали воду до 1,0 л, перемешивали и стерилизовали при давлении 1 атм (120°С) 20 мин. Левомицетин (50000 ЕД) добавляли в среду перед разливом в пробирки.

Посев исследуемого материала проводили на поверхность среды. Инкубацию проводили в течение 4-8 дней при 20-24°С. По характеру роста колоний, цвету и т.д. определяли вид дерматофитов.

Пример 1. Гидролизат кератина получали из куриного пера путем щелочного гидролиза в течение 72 ч при комнатной температуре, после чего гидролизат подвергали диализу против дистиллированной воды до достижения рН 7,0-7,6. Аминокислотный состав гидролизата кератина приведен в таблице 1. Содержание белка по биуретовой реакции в гидролизате — 25,0%.

Пример 2. Чистые культуры грибов дерматофитов М.canis, Т. verrucosum, Т.mentagrophytes var.gypseum, Т.rubrum, T.verrucosum высевали штрихом в чашки Петри на следующие питательные среды: Сабуро с гидролизатом кератина (предлагаемая) состава, г/л:

Дистиллированная вода — до 1,0 л

и стандартную среду Сабуро, г/л:

Глюкоза или мальтоза — 40,0;

Дистиллированная вода — остальное;

с добавлением левомицетина — 50000 ЕД;

Посевы помещали в термостате при 20°С. С интервалом в 1 сутки визуально отмечали появление и развитие колоний грибов.

Динамика проявления роста и развития грибов представлена в табл.2.

На среде с гидролизатом кератина (предлагаемая среда) рост дерматофитов отмечался на 1-5 сутки, идентификацию проводили на 4-8 день в зависимости от вида гриба. Плеоморфных изменений культур не зафиксировали.

Рост дерматофитов на стандартной среде Сабуро отмечался со 2-х по 7-е сутки инкубации. Культуры дерматофитов возможно было идентифицировать на 5-10 день в зависимости от вида гриба.

Пример 3. Материал от больного (волосы, чешуйки кожи и ногти) помещали в пробирки на следующие питательные среды: Сабуро с гидролизатом кератина, г/л:

Дистиллированная вода — остальное

и стандартную среду Сабуро. Посевы помещали в термостат при 24°С. С интервалом в 1 сутки визуально отмечали появление и развитие грибов.

Динамика проявления роста и развития грибов представлена в табл.3.

На среде с гидролизатом кератина (предлагаемая среда) рост М.canis, и Т.mentagrophytes var. gypseum отмечался на 1-2 сутки, идентификация была возможна с 4-5 суток, Т.rubrum рост — на 3-4 сутки, идентификация — на 5-7 сутки, рост Т.verrucosum — на 4-5 сутки, идентификация на 7-8 сутки. Плеоморфных изменений культур не зафиксировали.

Рост дерматофитов на стандартной среде Сабуро отмечался с задержкой на 2-3 суток по сравнению с предлагаемой средой.

В ряде случаев не было роста на всех средах в связи с отсутствием фрагментов грибов в материале от больного.

Пример 4. Материал от больного (эпилированные из очага волосы) был помещен в одну пробирку на среду Сабуро, в другую — на предлагаемую среду Сабуро с гидрализатом кератина состава, г/л:

Дистиллированная вода — остальное.

Инкубацию посевов проводили при 22°С. Появление колоний было отмечено примерно в одно время на обеих средах, но развитие колоний значительно быстрее шло на среде Сабуро с гидрализатом кератина, что проявлялось большим размером колоний (табл.4).

Пример 5. Материал от больного (волосы, чешуйки кожи и ногти) помещали в пробирки на среду Сабуро с гидролизатом кератина (предлагаемая), г/л:

Гидролизат кератина — 5,0; 10,0; 20,0; 30,0 или 40,0;

Дистиллированная вода — остальное

и стандартную среду Сабуро. Посевы помещали в термостат при 24°С. С интервалом в 1 сутки визуально отмечали появление и развитие грибов. Плеоморфных изменений культур не наблюдали.

Результаты, представленные в табл.5, свидетельствуют о том, что содержание гидролизата кератина в питательной среде для высева дерматофитов должно быть больше 10 г/л.

Таким образом, предлагаемый нами способ диагностики дерматомикозов путем высева клинического материала на среду Сабуро с гидролизатом кератина позволяет сокращать сроки выделения и идентификации культур грибов-дерматофитов. Кроме того, при использовании предлагаемой среды не происходит плеоморфных изменений культур. Высев дерматофитов предлагаемым способом позволяет проводить идентификацию для Т.mentagrophytes var.gypseum и М.canis — на 4-5 день, для Т.rubrum — на 5-7 день, для Т.verrucosum — на 7-8 день. В то же время для идентификации дерматофитов по патенту [4] требуется 20-22 дня. Ускоренный рост дерматофитов в случае добавления в среду гидролизата кератина наблюдается также при сравнении со способом их выделения на стандартной среде Сабуро, что позволяет проводить инкубирование при температуре 20-24°С.

Предлагаемая нами среда Сабуро с гидролизатом кератина имеет следующие преимущества: простота приготовления и сокращение сроков выделения и идентификации культур грибов-дерматофитов из материала от больного. Увеличение скорости роста культур дерматофитов происходит при содержании в питательной среде гидролизата кератина выше 10,0 г/л, в то же время повышение содержания гидролизата более 20,0 г/л не приводит к дальнейшему увеличению скорости роста культур и поэтому нецелесообразно.

Таблица 1
Аминокислотный состав гидролизата кератина
Аминокислоты Содержание
в мг/г % незаменимые аминокислоты
мг/г %
1 Аспарагиновая кислота 94,62 8,61
2 Треонин 58,94 5,36 58,94 13,08
3 Серин 121,15 11,02
4 Глутаминовая кислота 136,79 12,45
5 Пролин 178,69 16,26
6 Глицин 57,32 5,21
7 Аланин 40,48 3,68
8 Валин 94,06 8,56 94,06 20,87
9 Метионин 7,20 0,65 7,20 1,60
10 Изолейцин 57,39 5,22 57,39 12,74
11 Лейцин 97,27 8,85 97,27 21,59
12 Тирозин 19,42 1,77
13 Фенилаланин 42,30 3,85 42,30 9,39
14 Лизин 18,01 1,64 18,01 4,00
15 Гистидин 11,55 1,05 11,55 2,56
16 Аргинин 63,88 5,82 63,88 14,17
17 Цистеиновая кислота 56,63
18 Цистин 8,64
Всего 1164,34 100 450,60 100
Таблица 2
Динамика проявления роста и развития чистых культур грибов-дерматофитов
Появление колоний (дни) Идентификация гриба (дни)
Вид гриба Среда 1* Среда 2** Среда 1* Среда 2**
Trichophyton mentagrophytes var.gypseum 1-2 2-3 4-5 5-6
Trichophyton verrucosum 4-5 6-7 7-8 9-10
Trichophyton rubrum 1-2 3-4 4-5 5-6
Microsporum canis 1-2 2-3 4-5 5-6
Среда 1* — Среда Сабуро с гидролизатом кератина
Среда 2** — Стандартная среда Сабуро
Таблица 3
Динамика проявления роста и развития грибов-дерматофитов из материала от больного
Появление колоний (дни) Идентификация гриба (дни)
Вид гриба Среда 1* Среда 2** Среда 1* Среда 2**
Trichophyton mentagrophytes var.gypseum 1-2 2-3 4-5 5-6
Trichophyton verrucosum 4-5 6-7 7-8 9-10
Trichophyton rubmm 3-4 4-5 5-7 6-7
Microspomm canis 1-2 2-3 4-5 5-6
Среда 1* — Среда Сабуро с гидролизатом кератина
Среда 2** — Стандартная среда Сабуро
Таблица 5
Сроки идентификации грибов-дерматофитов в зависимости от содержания в среде гидролизата кератина
Срок идентификации колоний дерматофитов после высева (в сутках)
Вид гриба Содержание гидролизата кератина в среде (г/л)
5,0 10,0 20,0 30,0 40,0
Trichophyton mentagrophytes var.gypseum 5 5 6 5 5
Trichophyton verrucosum 8 7 6 7 7
Trichophyton rubrum 7 6 7 8 7
Microsporum canis 4 4 2 4 4

1. Разнатовский К.И., Родионов А.Н., Котрехова Л.П. Дерматомикозы: Руководство для врачей. — СПб.: Издательский дом СПбМАПО, 2003, 158 с.

2. Кашкин П.Н., Лисин В.В. Практическое руководство по медицинской микологии. Л.: Медицина, 1983.

3. Лещенко В.М. Лабораторная диагностика грибковых заболеваний. М., Медицина, 1977, 127 с.

4. Подхомутникова О.В., Воробьева О.Н., Коняхина И.Г., Лазарева Г.А., Типикина Л.М. Способ выделения дерматофитов из клинического материала. Патент РФ 2181144 (10.04.2002). МПК 7 С 12 N 1/14, С 12 Q 1/04.

5. Nakamura K., Yamada C. Process for producing chitin and chitisan from dermatophyte. WO 9314216, C 12 P 19/26 (22.07.1993).

6. Singh C.J. Characterization of an extracellular keratinase of Trichophyton simii and its role in keratin degradation. — Mycopathologia. — 1997. — V.137. — P.13-16.

1. Способ диагностики дерматомикозов путем высевания дерматофитов из клинического материала, заключающийся в культивировании патогенных грибов на плотной селективной среде Сабуро с добавлением антибиотика и последующей идентификацией, отличающийся тем, что в среду добавляют гидролизат кератина, полученный из куриного пера путем щелочного гидролиза в течение 72 ч при комнатной температуре с последующим диализом против дистиллированной воды до рН 7,0-7,6, при следующем соотношении компонентов, г/л:

Глюкоза 40,0
Пептон 10,0
Агар 18,0-20,0
Гидролизат кератина (в пересчете на сухое вещество) 10,0-20,0
Левомицетин 50 000 ЕД
Дистиллированная вода Остальное

при этом инкубируют посев при температуре 22-24°С в течение 4-8 дней, после чего проводят идентификацию вида колоний.

2. Питательная среда для выделения дерматофитов, содержащая глюкозу, пептон, агар и антибиотики, отличающаяся тем, что дополнительно содержит гидролизат кератина, полученный из куриного пера путем щелочного гидролиза в течение 72 ч при комнатной температуре с последующим диализом против дистиллированной воды до рН 7,0-7,6, при следующем соотношении компонентов, г/л:

источник

Выделение и идентификация грибов рода Candida у больных бактериальными и другими инфекциями

В данных рекомендациях использованы: Инструкция по идентификации грибов рода Candida, разработанная в Центральном кожно-венерологическом институте (Москва, 1957), руководства П. Н. Кашкина (1958, 1962), П. Н. Блинова (1964), П. Н. Кашкина, Н. Д. Шеклакова (1978), В. М. Лещенко (1982), П. Н. Кашкина, В. В. Лисина (1983) с учетом тридцатилетнего опыта работы нашего коллектива.

Исследование биоматериала на присутствие грибов рода Candida складывается из нескольких этапов:

  1. взятие материала от больных;
  2. микроскопическое исследование;
  3. микологическое исследование — выделение культур грибов и их идентификация.

Обычно микроскопическое исследование материала проводится одновременно с посевом или посев делается сразу, без микроскопии. От техники и времени во многом зависит результат исследования. Желательно делать посевы непосредственно после взятия материала.

Взятие и посев биоматериала от больных. У больных с бактериальными инфекциями зева (хронический тонзиллит, ангина, дифтерия и др.), а также у носителей дифтерийных бактерий для исследования берут стерильным тампоном (лучше стандартным — 2 мг ваты) материал со слизистых оболочек рта и зева: сначала с внутренней поверхности щек, неба, губ, затем с языка, особенно тщательно протирая тампоном спинку и область, прилежащую к корню языка, а в заключение — круговым движением из зева.

Тампоны следует быстро доставить в лабораторию (не позднее 2 ч), лучше произвести посев материала сразу после его взятия.

Посев можно сделать одним из следующих способов (однако важно при повторных исследованиях пользоваться одной и той же методикой):

  1. поместить тампон в колбу с 10 мл сусла или жидкой среды Сабуро с бусами, встряхивать в течение 5 мин (не замочив пробку), из полученного разведения 1:10 сделать мерно высев на чашку со средой Сабуро или кандида-агаром для выделения чистой культуры, подсчета выросших колоний и дальнейшего пересчета количества клеток на один тампон или на 1 мл смыва;
  2. пользуясь постоянно стандартной методикой посева, вращая тампон, засеять материал на чашку по секторам — с целью дальнейшего подсчета количества колоний, выросших в первичном посеве на чашке, и выделения чистой культуры гриба.

При заболеваниях дыхательных путей исследуют мокроту и слизь из полости рта и зева (по той же методике). Мокроту собирают в стерильную баночку с бусами и обязательно гомогенизируют в течение 5-10 мин в аппарате для встряхивания. Гомогенизированную мокроту разводят в любой жидкой питательной среде или физиологическом растворе (1:2; 1:10; 1:100 и т. д.) и высевают из каждого разведения по 0,1 мл на две хорошо подсушенные чашки со средой Сабуро или кандида-агаром. Количество разведений зависит от степени обсемененности материала грибами (предварительно определяется при микроскопическом исследовании мазков из мокроты). Можно оставить колбу с мокротой на сутки, чтобы посмотреть рост на чашках и при необходимости повторить посев из колбы, подобрав нужные разведения.

У больных кишечными инфекциями для исследования берут фекалии, желчь (при вирусном гепатите), слизь из зева и полости рта. Фекалии (навеска в 1 г) разводят 9 мл стерильного физиологического раствора в широкой пробирке или небольшой колбе, тщательно перемешивают стерильной стеклянной палочкой и оставляют на 10 мин. При значительной обсемененности фекалий грибами готовят последующие разведения. Из каждого разведения делают высевы по 0,1 мл на две чашки со средой Сабуро или кандида-агаром.

Порции А, В, С желчи при вирусном гепатите берут прокипяченным зондом, который вводят больному сразу после полоскания полости рта 3-5% раствором натрия гидрокарбоната. Посевы желчи делают мерно (по 0,1 мл) на чашки с плотными средами (Сабуро, кандида-агар, Плоскирева, Левина, желточно-солевой и кровяной агар) с целью дальнейшего изучения сравнительной обсемененности трех порций грибами и бактериями.

Читайте также:  Плавниковая гниль у гуппи левомицетин

При заболеваниях мочеполовой системы отделяемое из влагалища или уретры берут стерильным тампоном с использованием методик посева, описанных выше. Мочу следует брать стерильным катетером (за исключением маленьких детей, которым нужно просто тщательно обмыть половые органы) и сеять можно не мерно, так как в норме моча не содержит грибов. Лучше взять 50-100 мл мочи, отцентрифугировать ее, а осадок исследовать микроскопически и посеять на питательные среды.

При кожных заболеваниях исследуемым материалом могут быть кожные чешуйки, гной из очагов пиодермии, из-под ногтевого валика и т. д. Их берут стерильным стандартным тампоном. При поверхностном кандидозе берут те же материалы, пользуясь теми же методиками, но при висцеральном кандидозе и кандидозном сепсисе, кроме того, могут исследоваться кровь, спинномозговая жидкость, кусочки биопсированной ткани и трупный материал. Кровь берут стерильно из локтевой вены в объеме 5-10 мл и засевают во флакон с жидкой средой Сабуро сразу у постели больного.

Спинномозговую жидкость берут стерильно при пункции и так же, как кровь, засевают сразу в жидкую среду. Можно отцентрифугировать взятую жидкость, а осадок микроскопировать и засеять в жидкую среду. Кусочки тканей и органов исследуют гистологически [Хмельницкий О. К., 1984].

При бактериальных, вирусных, протозойных и других инфекциях при отсутствии клинических признаков кандидоза, когда грибы рода Candida являются не возбудителями, а лишь участниками микробных ассоциаций, достаточно обнаружить их, определить степень обсемененности ими, выделить в чистой культуре и идентифицировать до вида, а при затруднительных условиях работы можно закончить идентификацию на уровне рода.

В большинстве случаев взятый от больных бактериальными и другими инфекциями материал сразу после взятия изучают одновременно двумя методами — микроскопическим и микологическим (культуральным).

Микроскопическое исследование. Микроскопия материала позволяет лишь ориентировочно познакомиться с микрофлорой, а иногда выявить наличие грибов и приблизительно судить об их количестве в материале, чтобы решить вопрос о необходимости и степени разведения материала перед посевом. Этот метод предварительный и иногда совсем не используется. Микроскопируют неокрашенные и окрашенные препараты.

Для выявления грибов в неокрашенном состоянии на комочек исследуемого материала наносят каплю 10% едкой щелочи, или смеси спирта с глицерином (спирта и глицерина по 1 части, воды 2 части), или раствора Люголя (кристаллического йода 1 г, йодида калия 2 г, воды 150 мл). Препарат можно накрыть покровным стеклом.

Окрашивают препараты простым методом: 1% спиртовым раствором метиленового синего 1-3 мин, 1% водным раствором фуксина 0,5-1 мин. Используют также метод окраски по Граму, по Цилю — Нильсену, по Романовскому — Гимзе. Лучшие результаты в нашей лаборатории получают при окраске препаратов 1% спиртовым раствором генцианового фиолетового в течение 2-3 мин (удобно заранее пропитать этим раствором полоски фильтровальной бумаги, которые затем накладывают на препарат в каплю воды). При микроскопическом исследовании выявляют клетки типичной морфологии (овальные, круглые), в некоторых случаях с почкой (всегда одной), псевдомицелий, иногда хламидоспоры, определяют типы филаментации. Однако в препарате из исследуемого материала обычно видны только клетки грибов, редко псевдомицелий. Все другие элементы морфологии грибов выявляются в ходе исследования выделенной культуры гриба.

Выделение чистых культур грибов и их идентификация. Посевы материалов от больных делают на разные питательные среды с pH 6,0-6,5. Удобно использовать для этого плотную и жидкую среды Сабуро, мясопептонный агар, бульон с глюкозой и кандида-агар. Для количественного исследования посевы следует производить на плотные среды.

Засеянные среды выдерживают в термостате при температуре 37° C в течение 48 ч.

Второй этап микологического исследования проводится через двое суток после посева материала, когда на чашках вырастают колонии. Он включает четыре момента:

  1. отбор характерных однотипных колоний грибов и подсчет их; если засевалось несколько разведений, то подсчитывают количество колоний на двух чашках последнего разведения, где есть рост, а затем делят пополам и делают пересчет на 1 г, 1 мл или 1 тампон с учетом разведения и количества засеянного материала;
  2. микроскопия окрашенных (генцианвиолетом) препаратов для проверки чистоты культуры и изучения морфологии клеток, иногда при этом обнаруживается псевдомицелий и тогда сразу определяется принадлежность гриба к роду Candida;
  3. пересев из колонии на мясопептонный бульон (МПБ) с глюкозой или хламидоспор-агар для выявления псевдомицелия (если он не обнаружен в мазке из колоний);
  4. пересев из колонии на скошенную среду Сабуро или сусло-агар в пробирке для выделения чистой культуры.

В случае отсутствия типичных колоний грибов чашки сохраняются 7 дней и лишь тогда, если грибы не вырастут, выдается отрицательный ответ.

На втором этапе обеспечивается выделение чистой культуры гриба и начинается его идентификация.

Третий этап микологического исследования — идентификация выделенной культуры гриба, включающая определение принадлежности к дрожжеподобным грибам рода Candida и определение вида гриба.

В практических лабораториях обычно ограничиваются определением рода, а в научных целях и при необходимости более подробной характеристики гриба определяют его вид.

При определении принадлежности к дрожжеподобным грибам рода Candida возникает необходимость дифференциации их с истинными дрожжами — сахаромицетами.

Дрожжи образуют аскоспоры, не имеют псевдомицелия, вертицилл, хламидоспор, ферментируют углероды через 12-20 ч, растут при оптимальной температуре 20-30° C (температурный максимум роста 35° C), размножаются множественным почкованием, непатогенны для животных.

Дрожжеподобные грибы рода Candida не имеют аскоспор, образуют псевдомицелий, вертициллы, хламидоспоры (С. albicans), ферментируют углеводы через 24-48 ч (С. tropicalis через 18-20 ч), температурный оптимум роста 37° C, максимум 43° C, почкование концевое, патогенность для животных выражена различно (наиболее патогенны С. albicans). Первые два признака являются основными при дифференциации.

Практически, чтобы исключить принадлежность грибов к дрожжам, достаточно выявить псевдомицелий, который обнаруживается в мазках из МПБ с глюкозой через 48 ч, в пределах 7 сут. Для ускорения его образования посев инкубируется при температуре 37° C одни сутки, а затем остается при комнатной температуре (обычно псевдомицелий виден через 48 ч). Быстрее и проще псевдомицелий выявляется в посевах на хламидоспор-агаре, где через 18-20 ч обнаруживаются хламидоспоры, псевдомицелий и определяется тип филаментации.

Следовательно, в условиях практической лаборатории принадлежность гриба к роду Candida устанавливается на основании морфологических и культуральных признаков — формы клеток, наличия псевдомицелия и характерных колоний. Выделение чистой культуры от больного занимает 4 сут, идентификация до рода — еще 2-7 сут. Поэтому для сокращения срока выдачи ответа пересев на бульон для выявления псевдомицелия делают непосредственно из колоний на чашках (3-и сутки от начала исследования). Это позволяет дать ответ на 5-е сутки после взятия материала от больного: «Выделены дрожжеподобные грибы рода Candida». При использовании для первичного посева кандида-агара, а для пересева хламидоспор-агара ответ выдается существенно быстрее — на 3-и сутки от начала исследования. Отрицательный ответ выдается на 5-7-й день от начала исследования.

Предварительные ответы можно получить через 1-2 сут после первичного посева — при изучении выросших на чашках колоний.

Более подробная идентификация выделенных грибов с определением их вида проводится по следующей схеме:

  1. определение типа филаментации;
  2. выявление хламидоспор;
  3. изучение биохимических свойств — ферментации углеводов.

Для определения типа филаментации готовят блоки из картофельного или рисового агара по Н. П. Блинову. В упрощенном варианте эту работу можно выполнить так: расплавленный картофельный агар охлаждают до температуры около 60° C. Стерильной пипеткой наносят на стерильное предметное стекло около 0,5 мл такой среды, вносят в нее петлей исследуемую культуру, смешивают и покрывают стерильным покровным стеклом. Предметное стекло помещают в стерильную чашку Петри, на дне которой имеется стерильная фильтровальная бумага, пропитанная стерильной дистиллированной водой. Лучше между предметным стеклом и фильтровальной бумагой положить стерильные деревянные палочки, которые можно приготовить из спичек, удалив серу. Закрытую чашку с предметным стеклом инкубируют в термостате при 37° C в течение 48 ч, а затем микроскопируют. Если выявить филаментацию не удается, то чашку с предметным стеклом оставляют при комнатной температуре и микроскопируют препарат на 3-5-7-е сутки с момента приготовления препарата. Препараты микроскопируют сначала при малом, а затем при большом увеличении. На них выявляются тип филаментации и хламидоспоры одновременно. На одном предметном стекле можно приготовить два блока. В ходе исследования необходимо дополнительно увлажнять чашку дистиллированной водой. Аналогичным способом, но быстрее (через 18-20 ч) определяется тип филаментации и обнаруживаются хламидоспоры при посеве культуры из колоний на питательную среду хламидоспор-агар.

Можно определить тип филаментации и наличие хламидоспор без блоков: делать посев прямо на чашки с картофельным или рисовым агаром — радиально или по кругам (одновременно несколько культур), но при такой методике нужны высокая степень прозрачности среды и чашки из тонкого стекла.

Хламидоспоры выявляют обычно одновременно с изучением типов филаментации. Это крупные круглые образования, покрытые резко контурированной оболочкой, расположенные обычно на концах нитей псевдомицелия (см. главу I). Хламидоспоры лучше обнаруживаются на хламидоспор-агаре, на рисовом или картофельном агаре, особенно под покровным стеклом, где создаются менее благоприятные условия для развития грибов.

Ферментативную активность грибов определяют путем посева чистой культуры на ряд углеводов: лактозу, глюкозу, мальтозу, сахарозу, галактозу. Посевы инкубируют при 37° C, учет результатов производят через 48 ч и 7 сут. Вид гриба определяют на основании изучения совокупности признаков — морфологических, культуральных, биохимических (табл. 4).

Таблица 4. Краткие данные о морфологических, культуральных и биохимических свойствах наиболее распространенных видов грибов рода Candida
Вид гриба Морфология Характер роста не средах Ферментация углеводов
Форма клеток Типы филаментации Особые признаки на плотных — колонии на жидких лак- тоза глю- коза маль- тоза саха- роза галак- тоза
С. albicans Круглые или слегка овальные Mycotorulа; Мусоtoruloides Хламидо- споры Гладкие, выпуклые, кремовато-белого цвета, мягкой консистенции Рыхлый осадок, слегка мутноватый бульон кг кг кг
С. tropicalis Овальные Mycotorula; Mycotoruloides; Mycocandida Псевдокони- дин Морщинистые, беловато-серого цвета Кольцо, осадок, мутный бульон, на поверхности нежная серая пленочка, переходящая на стенки кг кг кг кг
С. pseudotropicalis Мелкие овальные Чаще Mycocandida Плоские, с куполообразным центром,серого цвета, сметанообразной консистенции Осадок, среда прозрачная кг кг кг кг
С. krusei Слегка вытянутые Mycotorula; Mycotoruloides; Mycocandida Плоские, гладкие, матовые, буровато-сероватого цвета Широкое кольцо, переходящее на стенки, мутная среда кг
С. guilliermondii Овальные Blastodendrion; Мусоcandida Нет бластоспор или их мало Выпуклые, гладкие, блестящие, беловато- кремоватого цвета (как у С. albicans) Осадок, cлабое пристеночное кольцо кг кг кг кг
Примечание. КГ — разложение до кислоты и газа.

Для более полной характеристики гриба иногда нужно убедиться в отсутствии аскоспор у выделенных грибов. Аскоспоры (споры внутри клетки в мешках) выявляются на среде Городковой: посевы выращивают при 28-30° C или при комнатной температуре. Микроскопировать мазки нужно с момента появления роста и до 2 нед. Можно посеять культуру просто на скошенный мясопептонный агар: у дрожжей аскоспоры появляются через 5-7 дней, у дрожжеподобных грибов рода Candida их нет.

Питательные среды.

  1. Плотная среда Сабуро. Взять 18 г агар-агара, 10 г пептона, 40 г глюкозы, 1 л дистиллированной воды; прокипятить до расплавления агара, профильтровать через ватно-марлевый фильтр, разлить во флаконы и пробирки, стерилизовать при температуре 115-120° C в течение 15 мин.
  2. Жидкая среда Сабуро. Готовится так же, но без агар-агара.
  3. Среда Сабуро с добавлением антибиотиков. Добавить пенициллин и стрептомицин по 100 ЕД на 1 мл среды (можно левомицетин) для подавления роста бактерий. Среда применяется при первичных посевах биоматериалов. Антибиотики добавлять перед употреблением среды.
  4. Сусло-агар. Солодовое сусло развести в 2 раза водопроводной водой и добавить 18-20 г агар-агара. Стерилизовать как среду Сабуро.
  5. Мясопептонный бульон (МПБ) с глюкозой. К стерильному МПБ асептично добавить стерильный раствор глюкозы из расчета конечного ее содержания в бульоне 2%. Можно добавить глюкозу с последующей стерилизацией среды при 100° C в течение 20-30 мин.
  6. Кандида-агар. Выпускается НИИ питательных сред (г. Махачкала). 48 г порошка высыпать в колбу с 1 л холодной дистиллированной воды, прокипятить 1-2 мин на слабом огне, профильтровать через ватно-марлевый фильтр, вновь довести до кипения. После охлаждения до 50-60° C разлить в стерильные чашки Петри, подсушить 40-50 мин в термостате.
  7. Хламидоспор-агар. Выпускается НИИ питательных сред (г. Махачкала). Среду готовят перед употреблением, так как в холодильнике она мутнеет, но если вынутую из холодильника среду подогреть, прозрачность ее восстанавливается. 30 г порошка высыпать в колбу с 1 л холодной дистиллированной воды, размешать, довести до кипения при помешивании, кипятить 1-2 мин, профильтровать через ватно-марлевый фильтр, разлить во флаконы, стерилизовать при 0,5 атм 20 мин. Сразу охладить до 50- 60° C, разлить слоем 2-3 мм на стерильные предметные стекла или в чашки Петри, подсушить в термостате 50-60 мин.
  8. Углеводы для определения ферментативных свойств гриба: 10 г пептона, 10-20 г одного из углеводов (лактоза, глюкоза, мальтоза, сахароза), 5 г хлорида натрия, 10 мл индикатора Андреде, 1 л дистиллированной воды. Стерилизовать так же, как МПБ с глюкозой.
  9. Картофельный агар. Берут 20 г тертого картофеля и настаивают в 1 л водопроводной воды в течение 4 ч при комнатной температуре, добавляют 20 г агар-агара, кипятят в течение 10- 15 мин, фильтруют, разливают в пробирки по 4-5 мл и стерилизуют при температуре 120° C в течение 30 мин.
  10. Картофельный агар с глюкозой. Готовят так же, как картофельный агар, но берут 100 г протертого картофеля и добавляют после фильтрования среды 10 г глюкозы. Стерилизуют, как среду Сабуро.
  11. Рисовый агар Блинова. Берут 20 г очищенного риса и кипятят в 1 л дистиллированной воды в течение 20-30 мин, фильтруют через бумажный фильтр и доводят фильтрат до первоначального объема дистиллированной водой, затем добавляют 20 г маннита, 10 г серина, 5 г сульфата натрия, 20 г агар-агара. Смесь кипятят до растворения агар-агара и осветляют лошадиной сывороткой (70 мл на 1 л среды) по обычным правилам. Стерилизация при температуре 110° C в течение 20 мин.
  12. Среда Городковой. Это мясопептонный агар с добавлением 0,25% глюкозы; стерилизация при температуре 110° C в течение 20 мин.

источник