Владельцы патента RU 2566422:
Изобретение относится к аналитической химии и касается количественного определения тетрациклина в молоке и молочных продуктах. Способ определения тетрациклина в молоке и молочных продуктах заключается в предварительном сорбционном концентрировании тетрациклина природным цеолитом и последующем определении данного аналита методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовым детектированием при длине волны 350 нм. Техническим результатом является повышение чувствительности оценки содержания тетрациклина в молоке и молочных продуктах, низкая себестоимость анализа, простота исполнения и экспрессность. 1 табл., 1 ил.
Изобретение относится к аналитической химии и касается количественного определения тетрациклина в молоке и молочных продуктах.
Потребность общества в росте производительности и снижении себестоимости пищевой продукции диктует необходимость применения антибиотиков в качестве ингибиторов патогенной микрофлоры. Среди антибактериальных препаратов, используемых в животноводстве и пищевой промышленности, ведущую роль занимают тетрациклины — антибиотики широкого спектра действия, характеризующиеся общим спектром и механизмом антимикробного действия, близкими фармакологическими и химическими свойствами. Особенно широко применяется тетрациклин.
Известен фотометрический способ определения тетрациклина, основанный на внесении в анализируемую пробу раствора хлорамина с последующим фотометрированием полученного раствора [1].
Недостатками способа являются низкая чувствительность (0,05 мг/см 3 ) и селективность, т.к. невозможно проводить определение в окрашенных растворах и в присутствии других антибиотиков.
Известен способ определения тетрациклина путем обработки анализируемой пробы раствором гидроксида натрия при рН 9,0-10,5 с последующим фотометрированием полученного раствора [2].
Токсические свойства тетрациклина (возникновение аллергических реакций, дисбактериозов, подавление активности некоторых ферментов, изменение микрофлоры кишечника и т.д.), проявляющиеся при его поступлении в организм человека в дозах, превышающих ПДК, делают необходимым проведение мониторинга сырья и продуктов животного происхождения, в частности молока и молочных продуктов, на наличие в них остатков данного антибиотика.
Недостатком данного способа является то, что в щелочной среде тетрациклин неустойчив. В зависимости от концентрации тетрациклина скорость деструкции настолько различна, что количественное определение с установленным доверительным интервалом на уровне 10% практически невозможно. Это означает, что в одной и той же пробе найденная концентрация тетрациклина может быть в 10 раз больше или в 10 раз меньше. Это обстоятельство является препятствием к применению данной методики.
Известен также способ сорбционно-цветометрического определения тетрациклина, основанный на сорбционном концентрировании тетрациклина на минеральном сорбенте и формировании на сорбенте окрашенного соединения при участии тетрациклина, хлорида железа (III) и [Fe(CN)6] 4- [3].
Недостатком данного способа является визуальное детектирование аналитического сигнала путем его сравнения с колориметрической тест-шкалой. Данный метод является полуколичественным, а регистрация сигнала субъективной, что ограничивает применение данной методики.
Недостатками способа определения остаточных количеств тетрациклина с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с масс-спектрометрическим детектором [4] является высокая себестоимость анализа, связанная с использованием дорогостоящих сорбционных патронов и оборудования.
Наиболее надежным из известных способов определения тетрациклина является иммуноферментный анализ (ИФА) [5].
К достоинствам ИФА можно отнести высокую чувствительность и возможность учета результатов через несколько часов от момента начала исследования.
К недостаткам метода относят сложность проведения анализа, трудности оценки специфичности полученных результатов и высокую стоимость.
Целью изобретения является создание способа определения содержания тетрациклина в молоке и молочных продуктах.
Технический результат заключается в возможности количественного определения содержания тетрациклина в молоке и молочных продуктах с достаточно высокой чувствительностью, селективностью, экспрессностью при низкой себестоимости анализа.
Метод основан на предварительном сорбционном концентрировании тетрациклина природным цеолитом Хотынецкого месторождения Орловской области и последующем его определении с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Изобретение включает стадии: а) пробоподготовка — удаление из молока или молочного продукта белков и молочного жира, б) сорбция тетрациклина цеолитом, в) десорбция тетрациклина с поверхности сорбента, г) хроматографическое определение тетрациклина.
Следующий пример представлен для того, чтобы наиболее полно проиллюстрировать изобретение.
Пример 1. Первая стадия определения тетрациклина в молоке и молочных продуктах включает пробоподготовку — удаление из пробы белков и молочного жира. Для этого в 100-250 см 3 анализируемого продукта вносят 2-3 см 3 концентрированной уксусной кислоты и термостатируют при 40- 45°C в течение 5-10 мин. Не рекомендуется вести процесс при температуре выше 55-60°С, т.к. это может вызвать частичную деструкцию тетрациклина. Далее пробу перемешивают и центрифугируют 5-7 мин при 3000-5000 об/мин. Центрифугат переносят в колбу, доводят рН среды до ≈2,55 М азотной кислотой и добавляют 25 см 3 универсальной буферной смеси (рН=2,50).
Вторая стадия: сорбция тетрациклина. В полученный центрифугат вносят 0,5-1,0 г цеолита, перемешивают 20 мин, фильтруют через фильтр «белая лента», промывают дистиллированной водой и 10 см 3 50% этилового спирта.
Третья стадия: десорбция тетрациклина с поверхности сорбента. Фильтр с цеолитом переносят в химический стакан, добавляют 15 см 3 насыщенного раствора оксалата аммония и термостатируют при 50°С в течение 5-7 мин. Полученную суспензию фильтруют через фильтр «синяя лента» и доводят объем до 20 см 3 дистиллированной водой.
Четвертая стадия: хроматографическое определение тетрациклина. Определение тетрациклина проводят методом обращено-фазовой (ОФ) ВЭЖХ с ультрафиолетовым (УФ) детектированием при длине волны 350 нм в режиме градиентного элюирования. Первоначально смесь элюируют раствором вода — ацетонитрил (10:90) в течение 2 мин на скорости 130 мкл/мин, затем в течение 0,1 мин содержание ацетонитрила уменьшают до 50% при скорости 170 мкл/мин, после чего элюирование ведут на скорости 200 мкл/мин, не изменяя состав смеси, до полного выхода из колонки тетрациклина. На рисунке 1 в качестве примера представлена типичная хроматограмма пробы молока с добавкой тетрациклина, получаемая на четвертой стадии предлагаемого способа (колонка 80×2 мм, Сепарон С18). Определяют площадь пика тетрациклина (обозначен символом * на рисунке 1) и по заранее построенному градуировочному графику его концентрацию в анализируемой пробе.
Построение градуировочной кривой. В 5 колб на 100 см 3 вносят 0,1; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0 см 3 16 мкг/мл раствора тетрациклина, 20 см 3 универсальной буферной смеси (рН=2,50) и доводят объем до метки дистиллированной водой. В каждую колбу вносят по 0,5-1,0 г цеолита и перемешивают 20 мин, фильтруют через фильтр «белая лента», промывают дистиллированной водой и 10 см 3 50% этилового спирта. Фильтр с цеолитом переносят в химический стакан, добавляют 15 см 3 насыщенного раствора оксалата аммония и термостатируют при 50°С в течение 5-7 мин. Полученную суспензию фильтруют через фильтр «синяя лента» и доводят объем до 20 см 3 дистиллированной водой. Полученный раствор хроматографируют при λ=350 нм, используя режим градиентного элюирования, как при анализе образца молока или молочного продукта. По полученным данным строят график в координатах «площадь хроматографического пика — содержание тетрациклина в пробе».
Результаты определения тетрациклина в молоке и молочных продуктах методом «введено-найдено» по предлагаемой методике представлены в таблице 1.
| Таблица 1 | ||
| Результаты определения тетрациклина в молоке и молочных продуктах (n=5, Р=0,95) | ||
| Введено, мкг/см 3 | Найдено, мкг/см 3 | Sr |
| 0,00о | — | — |
| 0,04о | 0,035±0,006 | 0,12 |
| 0,08о | 0,085±0,011 | 0,10 |
| 0,16о | 0,159±0,015 | 0,07 |
| 0,48о | 0,482±0,041 | 0,06 |
Анализ метрологических характеристик способа определения тетрациклина в молоке и молочных продуктах показывает высокую чувствительность, избирательность и воспроизводимость результатов. Предел определения тетрациклина по предлагаемой методике составляет 8 мкг/кг. Для сравнения предел определения тетрациклина одним из наиболее чувствительных, но при этом более дорогим (с точки зрения себестоимости анализа) методом ИФА [5] составляет до 36 мкг/кг.
Таким образом, предлагаемый способ определения тетрациклина в молоке и молочных продуктах, включающий стадию предварительного сорбционного концентрирования антибиотика природным цеолитом и последующее определение аналита методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, позволяет уменьшить погрешность анализа, отличается достаточной простотой исполнения и экономичностью, не требует применения дорогостоящего оборудования. Он может быть использован в практике лабораторий, осуществляющих химический анализ пищевых продуктов.
1. Соловей Н.В., Сааведра Н.Ф. Фотометрическое определение тетрациклина гидрохлорида. — Фармация, 1974, Т.23, №4, С.72-73.
2. Соболева О.Н. Способ определения тетрациклина: А.с. SU 1081487 А1; заявл. 1982.08.02; опубл. 1984.03.23.
3. Алыков Н.М., Алыкова Т.В., Салмахаева A.M. Способ экспрессного сорбционно-цветометрического определения тетрациклина в моче (патент РФ №2350950).
4. ГОСТ Р 53601-2009. Метод определения остаточного содержания антибиотиков тетрациклиновой группы с помощью высокоэффективной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором.
5. ГОСТ Р 53774-2010. Молоко и молочные продукты. Иммуноферментные методы определения наличия антибиотиков.
Способ количественного определения тетрациклина в молоке и молочных продуктах путем концентрирования тетрациклина природным цеолитом из пробы молока или молочного продукта, из которой удалены белки и молочный жир, с последующей десорбцией тетрациклина оксалатом аммония и определением методом ОФ-ВЭЖХ с ультрафиолетовым детектированием при длине волны 350 нм.
источник
ГОСТ 31694-2012 Продукты пищевые, продовольственное сырье. Метод определения остаточного содержания антибиотиков тетрациклиновой группы с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором
Текст ГОСТ 31694-2012 Продукты пищевые, продовольственное сырье. Метод определения остаточного содержания антибиотиков тетрациклиновой группы с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ
INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION
Метод определения остаточного содержания антибиотиков тетрациклиновой группы с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стан» дартизации установлены ГОСТ 1.0—92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2—2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные. правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены»
1 ПОДГОТОВЛЕН Федеральным государственным бюджетным учреждением «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»)
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 1 октября 2012 г. № 51 —2012)
За принятие проголосовали:
Краткое наименование страны по МК 3 , 40—200 мм 3 , 200—1000 мм 3 . 1—5см 3 [1];
— пробирки мерные стеклянные П-1-5-0.1ХС, П-2-10-14/23 по ГОСТ 1770;
— пипетки стеклянные градуированные по ГОСТ 29227;
— колбы мерные стеклянные К-2-100-2, К-2-1000-2 по ГОСТ 1770;
— виалы (флаконы полипропиленовые) вместимостью 15 и 50 см 3 с герметично закрывающимися пластмассовыми крышками (2);
— фильтры мембранные с размером пор не более 0.5 мкм (3];
— измельчитель-гомогенизатор лабораторный [4];
— встряхиватель вибрационный для пробирок орбитального типа движения с амплитудой встряхивания 3 мм и диапазоном скоростей от 150 до 2500 об/мин (5>;
— центрифугу лабораторную рефрижераторную со скоростью вращения ротора не менее 10000 об/с и диапазоном температур охлаждения от 4 °С до 20 °С, с адаптерами для пробирок вместимостью 15 см 3 и микроцентрифужных пробирок вместимостью 1,5 см 3 J6J;
— модуль термостатируемый нагревательный с системой отдувки растворителей инертным газом и максимальной температурой термостатирования 40 °С [7];
— баню ультразвуковую с рабочей частотой не менее 20 Гц и объемом не менее 1 дм 3 (8);
— колонку хроматографическую обращенно-фазную длиной не менее 50 мм с диаметром частиц сорбента не более 5 мкм;
— устройство вакуумное для твердофазной экстракции;
— картридж для твердофазной экстракции объемом не менее 12 см 3 , заполненный обращенно-фазным сорбентом с диаметром частиц не более 50 мкм;
— камеру лабораторную морозильную с цифровым контроллером температуры и рабочим диапазоном температур от минус 18 в С до минус 24 °С;
— холодильник бытовой с морозильной камерой, цифровым контроллером температуры и рабочим диапазоном температур от 0 °С до 5 °С.
4.2 При определении содержания антибиотиков тетрациклиновой группы применяют следующие реактивы;
— кислоту лимонную пищевую по ГОСТ 908, высшего сорта;
— муравьиную кислоту ч.д.а по ГОСТ 5848:
— натрий фосфорнокислый двузамещенный дигидрат ч.д.а по ГОСТ 245;
— соль динатриевую этилендиаминтетрауксусной кислоты (трилон Б) по ГОСТ 10652;
— ортофосфорную кислоту по ГОСТ 6552;
— стандартный образец тетрациклина гидрохлорида с содержанием действующего вещества не менее 90 % (9];
— стандартный образец окситетрациклина гидрохлорида с содержанием действующего вещества не менее 90 % [10);
— стандартный образец хлортетрациклина гидрохлорида с содержанием действующего вещества не менее 90 % [11);
— стандартный образец доксициклина с содержанием действующего вещества не менее 90 % (12);
— стандартный образец демеклоциклина с содержанием действующего вещества не менее 90 % [13].
Все реактивы должны относиться к подгруппе чистоты 2 (х. ч.) или 3 (ч.д.а.) по ГОСТ 13867.
5 Требования безопасности
5.1 Используемые в работе реактивы относятся к веществам 1-го и 2-го классов опасности по ГОСТ 12.1.007. при работе с ними необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005.
5.2 Помещения, в которых проводят анализ и подготовку проб, должны быть оборудованы приточно-вытяжной вентиляцией.
5.3 Операции по приготовлению и дозированию градуировочных растворов следует проводить под тягой 8 вытяжном шкафу.
5.4 В связи с тем, что при работе на хромато-масс-слектрометре используется сжатый азот, следует соблюдать требования ГОСТ 12.2.085 и правил устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением, действующих на территории государства, принявшего стандарт.
5.5 При выполнении измерений на хромато-масс-спектрометре следует соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019 и инструкцией по эксплуатации прибора.
5.6 К выполнению измерений методом высокоэффективной жидкостной хроматографии — масс-спектрометрии допускаются лица, владеющие техникой ВЭЖХ-МС/МС и изучившие инструкции по эксплуатации аппаратуры.
6 Порядок подготовки к проведению измерений
6.1.1 Отбор проб проводят в соответствии с методическими указаниями по отбору проб пищевой продукции с целью лабораторного контроля качества и безопасности, утвержденными на территории государства, принявшего стандарт.
6.1.2 Отбор проб органов, тканей животных и птицы производят в соответствии с (14]. Масса средней пробы органов, тканей животных и птицы не менее
6.1.3 Отбор проб молока и молочных продуктов производят в соответствии с ГОСТ 3622. Объем средней пробы молока не менее 200 см 3 , масса средней пробы образцов молочных продуктов не менее 250 г.
6.1.4 Отбор проб меда производят в соответствии с ГОСТ 19792. Масса средней пробы меда не менее 200 г.
6.1.5 Отбор проб яиц и яичного порошка производят 8 соответствии с ГОСТ 31654 и ГОСТ 30364.0. От яиц в качестве средней пробы отбирают не менее 12 шт.; масса средней пробы яичного порошка не менее 200 г.
6.2 Подготовка хромато-масс-спектрометрической системы к выполнению измерений
Подготовку хромато-масс-спектрометра к работе осуществляют в соответствии с техническим руководством по эксплуатации прибора.
При этом должны быть соблюдены следующие условия:
— температура окружающего воздуха. от 20 °С до 25 °С;
— атмосферное давление. от 84 до 106 кПа;
— напряжение в электросети. (220 + 10) В;
— частота тока в электросети. от 49 до 51 Гц;
— относительная влажность воздуха. от 40 % до 80 %.
6.3 Приготовление растворов
6.3.1 Приготовление раствора лимонной кислоты молярной концентрации 0,1 моль/дм 3
В мерную колбу вместимостью 1000 см 3 вносят 21 г лимонной кислоты, растворяют в деионизированной воде и доводят объем до метки этим же растворителем.
Срок хранения при комнатной температуре — не более 1 мес.
6.3.2 Приготовление раствора гидрофосфата натрия молярной концентрации 0,2 моль/ дм 3
В мерную колбу вместимостью 1000 см 3 вносят 35,6 г двузамещенного фосфата натрия, растворяют в деионизированной воде и доводят объем до метки этим же растворителем.
Срок хранения при комнатной температуре — не более 1 мес.
6.3.3 Приготовление буферного раствора
Для приготовления буферного раствора смешивают в соотношении 60:40 растворы лимонной кислоты и гидрофосфата натрия, полученные по 6.3.1 и 6.3.2, добавляют 37,2 г трилона Б, измеряют pH и, при необходимости, доводят значение pH до 4,0 ортофосфорной кислотой.
6.3.4 Приготовление растворов элюентов мобильной фазы А и Б
6.3.4.1 Для приготовления раствора элюента мобильной фазы А в мерную колбу вместимостью 1000 см 3 приливают деионизованную воду, добавляют 5 см 3 муравьиной кислоты и доводят объем до метки деионизованной водой.
Срок хранения при комнатной температуре — не более 1 мес.
6.3.4.2 Для приготовления раствора элюента мобильной фазы Б в мерную колбу вместимостью 1000 см 3 приливают метиловый спирт, добавляют 5 см 3 муравьиной кислоты и доводят объем до метки метиловым спиртом.
Срок хранения при комнатной температуре — не более 1 мес.
6.3.5 Приготовление градуировочных растворов
6.3.5.1 Приготовление градуировочных растворов тетрациклинов
Для приготовления градуировочных растворов тетрациклинов на весах с наибольшим пределом взвешивания 500 г взвешивают по 10 мг каждого стандартного образца по 4.1 (кроме демеклоциклина) и переносят в мерную пробирку вместимостью 10 см 3 . Добавляют метанол, помещают в ультразвуковую баню на 1 мин и доводят полученный раствор до метки метанолом.
Массовая концентрация каждого антибиотика тетрациклиновой группы в растворе Со составляет 1 мг/см 3 .
Срок хранения раствора — 3 мес при температуре минус 20 °С.
6.3.5.2 Приготовление раствора демеклоциклина (внутреннего стандарта)
Для приготовления раствора внутреннего стандарта на весах с наибольшим пределом взвешивания 500 г взвешивают 10 мг стандарта демеклоциклина гидрохлорида и переносят в мерную пробирку вместимостью 10 см 3 . Добавляют метанол, помещают в ультразвуковую баню на 1 мин, доводят полученный раствор до метки метанолом.
Массовая концентрация внутреннего стандарта в растворе составляет 1 мг/см 3 . Путем нескольких разбавлений доводят массовую концентрацию раствора внутреннего стандарта до значения 1 мкг/см 3 . Раствор с данной концентрацией используют для внесения 8 исследуемые образцы.
Срок хранения раствора — 3 мес при температуре минус 20 °С.
Перед применением растворы выдерживают при комнатной температуре, в темном месте, не менее 20 мин.
6.4 Хроматографические условия измерений
6.4.1 Хромато-масс-спектрометр включают и настраивают в соответствии с техническим руководством по его эксплуатации и устанавливают следующие хроматографические параметры:
— скорость потока элюента — 200 мм 3 /мин;
— объем вводимой пробы — 20 мм 3 .
6.4.2 Детектирование пиков проводится методом «регистрации выбранных реакций» 1 *. Для каждого антибиотика тетрациклиновой группы измеряется сигнал для двух фрагментных ионов согласно таблице 1.
Таблица 1 — Значения масс ионов-предшественников и ионов-фрагментов
Антибиотик тетрациклиновой группы
* mtz — отношение массы иона к его заряду.
Более интенсивный пик (верхний в каждой строке таблицы 1) служит для определения концентрации антибиотика, второй (нижний в каждой строке таблицы 1> используется для подтверждения правильности определения. Пики ионов-фрагментов с массой 410,1 тетрациклина и доксициклина различаются по времени их удержания в хроматографической колонке, определяемому на стадии разработки ВЭЖХ-МС/МС метода.
п «Регистрация выбранных реакций» — режим работы масс-слектрометра. при котором детектируется ионный ток только для выбранных фрагментных ионов выбранных ионов-прекурсоров.
6.5 Построение градуировочной характеристики
6.5.1 Градуировочную кривую строят при помощи матричной градуировки. Для этого проводят обработку «чистых» проб, приготовленных и проанализированных ранее в соответствии с требованиями раздела 7, не содержащих тетра-циклинов более 1 мкг/кг для каждого из антибиотиков, в зависимости от типа исследуемой матрицы. На стадии перерастворения перед введением в хроматограф в мерную пробирку вместимостью 5 см 3 , содержащую исследуемую «чистую» пробу, добавляют градуировочный раствор тетрациклинов по 6.3.5.1 с таким расчетом, чтобы окончательные массовые концентрации находились в пределах от 1 до 1000 нг/см 3 . Затем добавляют 50 мм 3 раствора внутреннего стандарта по
6.3.5.2 и необходимое количество мобильной фазы А по 6.3.4.1. доводя объем до 1 см 3 .
6.5.2 Для получения градуировочных данных используют не менее четырех уровней концентраций матричных градуировочных растворов.
6.5.3 При построении градуировочной зависимости для количественного определения тетрациклинов анализируют матричные градуировочные растворы различных уровней концентраций в условиях, описанных в 6.2 и 6.4. Затем строят графики зависимости массовой концентрации антибиотика тетрациклиновой группы от отношения площади хроматографического пика антибиотика тетрациклиновой группы к площади пика внутреннего стандарта для каждого фрагментного иона четырех антибиотиков тетрациклиновой группы. Образец графика приведен в приложении Б.
Построение графиков может проводиться при помощи программы обработки данных ВЭЖХ-МС/МС или при помощи программы Excel (Microsoft Office).
6.5.4 Расчетные концентрации для обоих фрагментных ионов каждого антибиотика тетрациклиновой группы должны совпадать в пределах 20 %.
Градуировочная зависимость считается приемлемой, если рассчитанное значение квадрата коэффициента корреляции для градуировочной кривой каждого фрагментного иона каждого антибиотика тетрациклиновой группы не менее 0,98.
6.6 Подготовка лабораторной посуды и реактивов
6.6.1 Мойку и сушку посуды следует проводить в отдельном помещении, оборудованном приточно-вытяжной вентиляцией. Не допускается проведение подготовки посуды 8 данном помещении для других видов анализов. Для сушки лабораторной посуды и подготовки реактивов необходимо использовать отдельные сушильные шкафы.
6.6.2 Стеклянную посуду подвергают стандартной процедуре очистки лабораторной посуды с последующей последовательной промывкой органическими растворителями: этилацетатом (однократно), ацетоном (дважды).
6.6.3 Процедуру промывки органическими растворителями следует проводить в вытяжном шкафу. Рекомендуется на стадиях промывки использовать ультразвуковую баню. Окончательную сушку посуды проводят в сушильном шкафу, установленном в вытяжном шкафу, при температуре от 105 *0 до 110 °С.
7 Порядок выполнения измерений
7.1 Обработка проб органов, тканей животных, яиц, яичного порошка, молока, молочных продуктов и меда
7.1.1 Мышечную ткань предварительно очищают от грубой соединительной ткани. Яйца отделяют от скорлупы. Каждую пробу измельчают на гомогенизаторе и взвешивают по 1,0 г гомогенизированной пробы в виале на лабораторных весах с наибольшим пределом взвешивания 200 г. В виалу добавляют 50 мм 3 раствора внутреннего стандарта по 6.3.5.2 и оставляют для уравновешивания на 15 мин. Затем добавляют 10 см 3 экстрационного буферного раствора по 6.3.3, закрывают крышкой и интенсивно перемешивают на встряхивателе в течение 15 мин. Далее виалы с образцами помещают на предварительно охлажденную до 4 °С центрифугу и центрифугируют при 4000 об/мин в течение 20 мин. Процедуру экстракции и центрифугирования повторяют еще один раз. Объединенные экстракты собирают в чистые виалы.
7.1.2 1,0 г меда взвешивают на лабораторных весах с наибольшим пределом взвешивания 200 г в виале вместимостью 50 см 3 . В виалу добавляют 50 мм 3 раствора внутреннего стандарта по 6.3.5.2 и оставляют для уравновешивания на 15 мин. Затем добавляют 20 см 3 экстрационного буферного раствора по 6.3.3, закрывают крышкой и интенсивно перемешивают на встряхивателе в течение 1 мин. Далее виалы с образцами помещают на предварительно охлажденную до 4 °С центрифугу и центрифугируют при 4000 об/мин в течение 20 мин.
7.2 Проведение твердофазной экстракции и подготовка к хроматографированию
7.2.1 Для проведения твердофазной экстракции картридж для ТФЭ заполняют 0,5 г сорбента. Предварительно картридж кондиционируют 6 см 3 метилового спирта и уравновешивают 6 см 3 бидистиллированной воды. Затем наносят объединенный экстракт и вновь промывают 6 см 3 бидистиллированной воды. Тетра-
циклины элюируют с сорбента при помощи 6 см 3 мобильной фазы Б. Полученный элюат упаривают на нагревательном модуле в токе воздуха до 0,5 см 3 при температуре 40 °С.
7.2.2 Для перерастворения и подготовки к хроматографированию объем полученного упаренного элюата в мерной пробирке вместимостью 10 см 3 доводят до 1 см 3 при помощи мобильной фазы А и помещают на ультразвуковую баню на 1 мин. Полученный экстракт фильтруют через мембранный фильтр и используют для ВЭЖХ-МС/МС анализа.
7.3.1 Для очистки образцов к навеске образца молока массой 1 г, помещенной в виалу, добавляют 100 мм 3 раствора внутреннего стандарта по 6.3.5.2 и оставляют для уравновешивания на 15 мин. Затем добавляют 3 см 3 ацетонитрила, закрывают крышкой и интенсивно перемешивают на встряхивателе в течение 3 мин, затем оставляют на 15 мин 8 горизонтальном положении для последующего уравновешивания. Далее виалу с образцом помещают на предварительно охлажденную до 4 °С центрифугу и центрифугируют при 4000 об/мин в течение 20 мин. Полученный раствор переносят в мерную пробирку вместимостью 10 см 3 и упаривают до 1 см 3 на нагревательном модуле в токе воздуха при температуре 40 °С. К полученному остатку добавляют 9 см 3 буферного раствора 6.3.3 и помещают на ультразвуковую баню.
7.3.2 Процедуру твердофазной экстракции осуществляют в соответствии с
7.2.1, а перерастворение и подготовку к хроматографированию — в соответствии с
7.4.1 Для определения остаточного содержания тетрациклинов и их эпиформ проводят анализ в условиях, указанных в 6.4.
7.4.2 Время удерживания антибиотиков тетрациклиновой группы определяют при анализе градуировочных растворов.
7.5 Контроль качества измерений
7.5.1 Каждая серия измерений включает в себя несколько степеней подтверждения качества измерений.
7.5.2 Для исключения контаминации образца используемыми реагентами проводят обработку «чистого образца» в соответствии с 7.1 — 7.3 в зависимости от типа исследуемой матрицы.
7.5.3 Для учета матричного эффекта при расчете остаточных содержаний антибиотиков тетрациклиноеой группы используют матричную градуировку по 6.5.
7.5.4 Проводят испытание образца с обработкой пробы в соответствии 7.1 —
7.3 в зависимости от типа исследуемой матрицы.
7.6 Обработка результатов хроматографического анализа
7.6.1 Расчеты содержания антибиотика тетрациклиноеой группы выполняют с помощью градуировочной характеристики следующим образом. Вычисляют отношение площади пика фрагментного иона к площади внутреннего стандарта с помощью программы обработки спектров поставляемой вместе с хромато-масс-спектрометром. Затем, для найденного значения (абсциссы) находят точку на градуировочной характеристике. Ордината этой точки является искомым содержанием (приложение Б).
7.6.2 Окончательные результаты измерений содержания тетрациклинов округляют до целого значения и выражают в микрограммах на килограмм.
8.1 Установленный в настоящем стандарте метод обеспечивает выполнение измерений содержания тетрациклинов с расширенной неопределенностью результатов аналитических измерений при коэффициенте охвата 2, указанной в таблице 2.
Примечание — Значения относительной расширенной неопределенности, указанные а таблице 2. соответствуют границам относительной погрешности результатов измерений при Р = 0,95.
Таблица 2 — Значения относительной расширенной неопределенности измерений (при коэффициенте охвата к = 2) V, %, в диапазонах измерений содержаний антибиотиков тетрациклиноеой группы, мкг/кг
Относительная расширенная неопределенность У», %, при Р = 0,95 и диапазоне измерений содержания тетрациклинов, мкг/кг
источник
Номер патента: 1081487
1 Ю (1 И СОЮЗ СОВЕТСКИХПО 4 ИИЕПНемаРЕСПУБЛИК 48 21/78 ИЯ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ а,)Ъ4 61 ( ф г»Фармар. Орга 1981, ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИ(56) 1, Гров Д.С. ипо лабораторным мето(54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТЕТРАЦИКЛИНА путем обработки анализируемой пробы раствором гидрокснда натрия при рН 9,5 10 с последующим фотометрированием полученного раствора, отличающийся тем,что, с целью повышения селектнвности способа, полученный после обработки анализируемой пробы гидроксидом натрия раствор предварительновыдерживают до появления красногоцвета.1081487 а б л и ц а 1 Т бе на 25 мл. Берут приготовленногораствора 0,25, 0,5, ,2,5 мл в мерные колбы на 25 мл и доводят до метки раствором едкого натра, рН которого 8,5. Оптическую плотность измеряют череэ час на ФЭКпри светофильтре М б в кювете с толщиной слоя2 см. Предел обнаружения 0,010 мг/мл Оптическая плотность А Содержание, мг/мл 0,090 0,05 0,185 0,010Изобретение относится к аналитической химии, а именно к методамколичественного определения тетрациклина, и может найти применениепри анализе лекарственных препаратов и биологических объектов.Известен способ количественногоопределения тетрациклина, заключающийся в том, что точную навеску препарата растворяют в воде, обрабатывают раствором соляной кислоты ихлорного железа. Полученный окрашенный раствор фотометрируют 1 3Недостатком способа является низкая чувствительность (0,05 мг/мл )и неселективность, так как невозможно проводить определение в окрашенных растворах и в присутствиидругих антибиотиков.Известен также фотометрическийспособ определения тетрациклина путем обработки анализируемой пробыраствором хлорамина с последующимфотоколориметрированием полученногораствора ( 2 ,Недостатком данного способа такжеявляются малая чувствительность( 0,05 мг/мл )и недостаточная селективность,Наиболее близким к изобретениюпо технической сущности и достигаемому результату является способ фотометрического определения тетрациклина, основанный на обработке анализируемой пробы раствором гидроксиданатрия при рН 9,5-10 с последующимфотоколориметрированием полученногоокрашенного раствора через 5 мин ГЗНедостатком известного способаявляется его низкая селективность,так как в этих же условиях другиелекарственные вещества (окситетрациклин, новокаин, олеандомицин,витамины) окрашивают раствор такжев желто-зеленый цвет.Целью изобретения является повышение селективности способа.Поставленная цель достигаетсятем, что согласно способу, заключающемуся в обработке анализируемойпробы раствором гидроксида натрияпри рН 9,5-10 с последующим фотометрированием его, полученный после обработки анализируемой пробы гидроксидом натрия раствор предварительно выдерживают до появления красного цвета.П р и м е р 1. Точную навескупрепарата (0,0125 г ) растворяют вдистиллированной воде в мерной кол» П р и м е р 2. Точную навескупрепарата (0,0125 г) растворяют вдистиллированной воде в мерной колбе на 25 мл. Берут приготовленногораствора 0,25, 0,5, ,2,5 мл в мер 5 ные., колбы на 25 мл и доводят до мет»ки раствором едкого натра, рН которого 10,5 мл и далее поступают, какв примере 1. Предел обнаружения0,08 мг/мл.10 П р и м е р 3. Точную навеску ), препарата (0,0125 г) растворяютв дистиллированной воде в мернойколбе на 25 мл. Берут приготовленного раствора 0,25, 05,2,5 млв мерные колбы по 25 мл и доводятраствором едкого натра, рН которбго 10,0, далее поступают, как впримере 1, Предел обнаружения0,005 мг/мл.20 П р и м е р 4. Точную навескупрепарата (0,0125 г ) растворяют вдистиллированной воде в мерной колбе на 25 мл, Берут приготовленногораствора 0,25, 0,5,2,5 мл в мерные колбы на 25 мл и доводят до метки раствором едкого натра, рН которого 9,5, далее поступают как в примере 1. Предел обнаружения 0,005 мг/МлП р и м е р 5. Точную навеску:препарата (0,0125 г) растворяют вЗ 0 дистиллированной воде в мерной колбе на 25 мл. Берут приготовленногораствора 0,25,0,5,2,5 мл в колбына 25 мл для трех серий, доводятдофметки раствором едкого натра, рН35 которого 9,5-10,0; выдерживают пер. вую серию 45 мин, вторую — бО мин,третью — 75 мин. Пределы обнаружения для трех серий соответственноОу 001 мг/млу 0005 мг/мл и 0,003 мг/мл.П р и м е р б. Приготовление калибровочного графика для количественных определений тетрациклина щелочью.,Точную навеску препарата(,0,0125 г ) растворяют в дистиллиро-ванной воде в.мерной колбе на 25 мл45 Берут приготовленного раствора0,25,0,5,2,5 мл в мерные колбына 25 мл, доводят до метки раствором едкого натра, рН которого 9,510,0, и далее поступают как в приме 50 ре 1.Раствор продукта реакции подчиняется основному закону светопоглощения в пределах концентраций 5 10—5 10 2 мг/мл,55 Калибровочный график для количественных определений тетрациклинащелочью приведен в табл. 1,Оптическаяплотность А 0,275 0,315 0,450 0,540 0625 0,720 Результат определения тетрацикли, на в смеси с окситетрациклином приведен в табл. 2. 0,805 0,900 Таблица 2 Метрологические характеристики: и а 10, ОМ 0,96, С2,2 Найдено препарата щЧ таЪг/млу в навеске, Опыт М100,5= 2,56Ч=1,6 0,01950 02030,0203 .0,0200 0,363 0,370 0,370 0,365 98,5101,5101,5100,0 . 2. 3. 4. Щ 2,2 16.фй ф 0,02040,2010,0197 5. 100,5 + 1,1 б,7,0,0201 8. 0,0204 0,0195 10,98,5 ф П р и м е р 8. КоличественнОе оП мп, далее поступают, как в приределение тетрациклина в смеси с но- . мере б и расчеты ведут по формуле(1) вокаином. 55Точную навеску тетрациклина Результат определения тетрацик 0,1000 г и новокаина 10 г 1 раст- лина в смеси с новокаином приведен воряют в воде в мерной колбе на ,в табл. 3. 0,015 0,020 0,025 0,030 0,035 0,040 0,045 0,050 0,373 0,368 0,365 0,368 0,374 0,362 1 П р и м е р 7. Количественное определение тетрациклина в смеси с окситетрациклином. Точные навески 0,1000 г тетрациклина и 0,5000 г окситетрациклинарастворяют.в воде в мерной колбе на200 мл. В мерную колбу на 25 мл переносят 1 мл раствора и далее поступают, как описано в примере б. Расчет 10 содержания,тетрациклина в навеске вмг проводят по ФормулеФ 25200, (1 15где В — содержание тетрациклина,мг/мп. 102,0 100,5 100,0 100,5 102,0(О, 1000 г ) и олеандомицина (010500 г)растворяют в воде в мерной колбе3 Таблица 4тШЙ Найдено препарата Метрологические ха- рактеристики 3В навеске, и = 10, с(, 0,95,мг Е 22 Опыт а(мг/мл) Х фг 100,451,23 Ч щ 1,11 98,5 99,5 2. 101,5 101,5 3. ЕЧЧ 111122 0 77 3 Го 40,368 0,364 0,370 5. 100,45 + 0,77 6. 7. 0,368 8. 0,3660,371 9,10 0,363 0,370 0,370 0,365 0,373 0,368 0,365 0,368 0,374 0,362 0,363 0,364 0,370 0,371 0,0195 0,0203 0,0203 0,0200 0,0204 0,0201 0,0197 0,0201 0,0204 0,0195 0,0195, 0,0198 0,0202 0,0202 0,0201 0,0198 0,0202 0,0201 0,0200 0,0202 102,0 100,5 100,0 100,5 102,0 е вт а 1на 200 мл, далее поступаютгкак впримере 6 и расчеты ведут по Формуле (1).Результаты определения тетрациклина и смеси с олеандомицином при, веВены в табл 4,1081487 в и Составитель ВШкилькова Редактор В. цанко Техред,К.Кузьма . Корректор М. шарохинЗаказ 1537/36 Тираж 823 Подписное ВНИИПИ ГосударственнОго комитета СССР по делам .изобретений и открытий 113035, Москва, 3-35, Раушская наб., д. 4/5а4 МФилиал В 1 П «Патент», г. Ужгород, ул. Проектная, 4 В аналогичных условиях при опре- делении тетрациклина известным спо-собом фотометрированне проводят через 5 мин пОсле обработки аналчзируемой пробы. В течение этого времени раствор приобретает светлый желто-зе Леный цвет. В анализируемой пробе тетрациклина с другими препаратами, например окситетрациклином, олеандомйцином, новокаином, в растворах происходит наложение цветов и фотомет-» рируется смесь веществ. Следовательно, определить тетрациклин в присутствии других лекарственных препаратов известным способом невозможно,Таким образом, предлагаеьый способ имеет высокув,чувствительность (0,005 мг/мл) и селективность, так каК позволяет определить тетрациклин в присутствии других лекарственных препаратов.Ф
ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
источник
Определение антибиотиков тетрациклинового ряда в пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с после колоночной реакцией и флуоресцентным. — презентация
Презентация была опубликована 4 года назад пользователемТатьяна Харламова
Презентация на тему: » Определение антибиотиков тетрациклинового ряда в пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с после колоночной реакцией и флуоресцентным.» — Транскрипт:
1 Определение антибиотиков тетрациклинового ряда в пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с после колоночной реакцией и флуоресцентным детектированием МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. Ломоносова Химический факультет Кафедра аналитической химии Москва, 2014 И. Д. Каргин Научный руководитель: д.х.н., проф. А.В. Пирогов
2 2 Тетрациклины Тетрациклин (TC) ( г/моль) Окситетрациклин (OTC) ( г/моль) Доксициклин (DC) ( г/моль) ПДК = 10 нк / г
3 Фармaкологические препараты Ветеринария Животноводство Применение тетрациклина 3 ПДК = 10 нк / г
4 Создание способа чувствительного определения антибиотиков тетрациклинового ряда с использованием микроэмульсий методом ВЭЖХ с флуоресцентным детектированием Изучение влияния состава микроэмульсий на флюориметрические свойства исследуемых соединений Цели работы 4
5 5 Типы микроэмульсий: А – «масло в воде» В – «вода в масле» С – биконтинуальная микроэмульсия Структура микроэмульсии н-октан Вода
7 7 УФ-детектирование Хроматограмма модельной смеси тетрациклинов (с = 10 мкг/мл каждого ТС). Колонка Zorbax Eclipse XDB-C × 4.6 мм (5 мкм). Градиентный режим, элюент – (А) 0.01 M р-р щавелевой кислоты, pH 3; (В) MeCN. Градиент: (0-4 мин) 20% (В), (4-10 мин) линейное увеличение до 40% (В). F = 1 мл/мин, Т = 30°C. Спектрофотометрическое детектирование при λ = 359 нм. Соединениеt R, мин Ширина пика, минRsRs AsAs c min, нк/мл OTC – TC DC
8 8 Режим МЭЖХ mAU t R,мин OTC + TC DC Хроматограмма модельной смеси тетрациклинов (с = 1 мкг/мл каждого). Элюент – (А) — МЭ (3.3% ДДСН, 0.8% н-гептана, 8% н-бутанола), (Б) — МЭ (2% ДДСН, 0.6% н-гептана, 6% н-бутанола). pH 3, F = 1 мл/мин, Т = 30°C. Спектрофотометрическое детектирование при λ = 359 нм. Подвижная фаза Соединен ие t R, мин Ширина пика, мин Rs c min, нк/мл МЭ 2% ДДСН, 0.6% гептана, 6% н-бутанола OTC –180 TC DC MeCN/0.01М р-р щавелевой к-ты OTC –110 TC DC (А) (Б)
9 Комплексообразование с катионами металлов Предполагаемые структуры комплексов тетрациклина с катионами магния и кальция У комплекса тетрациклина с катионом магния наблюдается сильное увеличение интенсивности флуоресценции ( ̴ 20 раз) 9 g g Спектры флуоресценции (λ Ex / λ Em = 385 / 512 нм): 1 – 10 мкг/г ТС в МЭ 2 – 10 мкг/г ТС в МЭ + Mg 2+ (избыток) 1 2
10 10 с(ТС) = 10 мкг/мл, λ Ex / λ Em = 385 / 512 нм Выбор pH и концентрации ионов Mg 2+
11 Название ПАВСтруктурная формулаI fl, у.е. Додецилсульфат натрия (ДДСН) 45 Докузат натрия (ДЗН)41 Цетилтриметиламмония хлорид (ЦТАХ) ДДСН ДКЗ ЦТАХ Изучение влияния природы ПАВ на флуоресценцию комплексов ТС с Mg 2+ с(ТС) = 10 мкг/мл, λ Ex / λ Em = 385 / 512 нм
12 12 Схема проведения после колоночной реакции Насос 1 Насос 2 Колонка Реакционная петля ФЛ детектор Ввод пробы 20% MeCN 80% 0.01 M р-ра щавелевой к-ты рН М р-р MgCl 2 в МЭ состава: 4% ДДСН 1.2% н-гептана 12% н-бутанола рН 9 Металлический капилляр L = 2 м D = 0,25 мм V = 980 мкл ТС Элюат ТС-Mg рН 7.8 Т = 50°С
13 Кинетика реакции комплексообразования Реакция тетрациклина с ионами магния в среде микроэмульсии Условия: МЭ (2% ДДСН, 0.6% гептана, 6% н-бутанол), содержащая 0.06 М Mg 2+, pH 9, с(ТС) = 10 мкг/мл Зависимость интенсивности флуоресценции комплекса ТС с Mg 2+ от времени, λ Ex / λ Em = 385 / 512 нм. 13
14 Варьирование температуры и скорости подачи элюента 14 Скорость подачи элюента и микроэмульсии с магнием одинакова С ростом температуры понижается вязкость МЭ
15 15 Хроматограмма модельной смеси тетрациклинов с концентрациями 0.05 мг/мл. Элюент: А – 0.01 M р-р щавелевой кислоты, pH = 3; В – MeCN. Градиентный режим: 0 мин – 20% А, (0 – 9) мин – 35% А, (9 – 14) мин – 35% А, (14 – 18) мин – 20% А. F = 0.4 мл/мин, Т = 50°C. Послеколоночная реакция – 60 мМ раствор MgCl 2 в МЭ (4% ДДСН, 1.2% н-гептана, 12% н-бутанола). F = 0.4 мл/мин, V = 100 мкл, λ Ex / λ Em = 385 / 512 нм. ОФ-ВЭЖХ с после колоночной реакцией Соединениеt R, мин Ширина пика, минRsRs AsAs с min, нк/мл OTC – TC DC
16 Пробоподготовка фармацевтических препаратов Навеска препарата Экстракция в микроэмульсии на УЗ бане Центрифугирование Разбавление подвижной фазой 16 2 минуты, 16 тыс. об./мин Объем МЭ – 10 мл Время экстракции – 5 минут Температура – 60 о С Навеска г Разбавление в 100 раз смесью 80% 0.01 M р-ра щавелевой кислоты 20% MeCN
17 Анализ тетрациклиновой мази 17 Хроматограмма тетрациклиновой мази 3%. ТС
18 Степени извлечения тетрациклина из мазей 18
19 Пробоподготовка молока 5 мл молока мл буферного р-ра Ультразвуковая обработка Центрифугирование ТФЭ Разбавление подвижной фазой 19 5 минут, 16 тыс. об./мин Время обработки – 5 минут 0.1 М р-р ЭДТА в буферном растворе Мак Илвейна, рН 4 Разбавление 0,01 M р-ром щавелевой кислоты 2 минут, 16 тыс. об./мин 3 мл MeCN, 3 мл H 2 O, 3 мл буф. р-ра 12 мл над осадочной жидкости 3 мл H 2 O, 3 мл буф. р-ра 1 мл MeCN
20 20 Хроматограмма реального объекта (молоко) Участок хроматограммы образца молока «Лианозовское».
21 21 Хроматограмма реального объекта (молоко) Хроматограммы холостого образца молока (A) и молока с добавкой тетрациклинов (Б). Концентрации добавок составляли 20, 20 и 40 мкг/л для OTC, TC и DC соответственно.
22 22 Выводы 1. Впервые показано, что интенсивность флуоресценции комплексов тетрациклинов с ионами Mg 2+ в микроэмульсионной среде в 1.8 раза выше по сравнению с водно- органической средой. 2. Изучено влияние природы ПАВ в составе микроэмульсии на интенсивность флуоресценции комплексов тетрациклинов. Показано, что максимальная интенсивность флуоресценции наблюдается в МЭ на основе анионного ПАВ ДДСН. 3. Впервые предложена схема проведения после колоночной реакции комплексообразования тетрациклинов с ионами Mg 2+ в среде микроэмульсий. 4. Выбраны условия чувствительного и селективного хроматографического определения тетрациклинов в виде комплексов с флуоресцентным детектированием в фармацевтических препаратах (мази и таблетки) и пищевых объектах (молоко). Пределы обнаружения составили 5, 8 и 25 нк/мл для TC, OTC и DC соответственно. 5. Выбраны условия извлечения тетрациклинов из молока, степени извлечения составили 87, 82 и 68% для TC, OTC и DC соответственно. Также в ходе дополнительной очистки образцов с помощью ТФЭ картриджа Strata XDB-L достигнута степень концентрирования тетрациклинов, равная В работе показана перспективность использования МЭ для количественного извлечения тетрациклина из лекарственных форм на основе мазей. Степени извлечения составили %. Время пробоподготовки занимает 15 минут.
источник
Состав жидкостного хроматографа. Детекторы и устройства для сбора данных. Применение высокоэффективной жидкостной хроматографии в анализе антибиотиков. Оценка препарата Рулид, Азитромицин с ее помощью. Расчет концентрации антибактериальных глазных капель.
Государственное Бюджетное Общеобразовательное Учреждение
Высшего Профессионального Образования
Курский Государственный Медицинский Университет
Кафедра фармацевтической, токсикологической и аналитической химии
Курсовая работа по фармацевтической химии
« Использование ВЭЖХ в анализе антибиотиков»
студентка 4 курса, 3 группы
Дорутова Анастасия Александровна
Кукурека Александр Владимирович
Глава 1. Общая характеристика метода ВЭЖХ
1.1 Высокоэффективная жидкостная хроматография
1.2 Состав жидкостного хроматографа
1.3 Насосные системы и инжекторы
1.4 Хроматографические колонки
Детекторы и устройства для сбора данных
Глава 2. Антибиотики и их классификация
2.2 Классификация антибиотиков
Глава 3. Применение высокоэффективной жидкостной хроматографии в анализе антибиотиков
3.1 Применение ВЖЭХ в анализе антибиотиков группы цефалоспоринов и гликопептидов
3.2 Применение ВЭЖХ в анализе антибиотиков группы хинолонов и фторхинолонов
3.3 Применение ВЭЖХ в анализе противоопухолевых антибиотиков
3.4 Применение ВЭЖХ в анализе антибиотиков группы пенициллина
3.5 Использование ВЭЖХ в анализе антибиотиков группы гликопептидов и рифамицинов
3.6 Анализ препарата Рулид и Азитромицина с помощью ВЭЖХ
3.7 Определение концентрации антибактериальных глазных капель
В настоящее время ВЭЖХ занимает ведущие позиции среди других методов хроматографии. Современная высокоэффективная жидкостная хроматография реализована в различных вариантах: обращеннофазовая, нормально фазовая, эксклюзионная, экстракционная, ионообменная и другие, что позволяют разделять различные смеси лекарственных средств. ВЭЖХ является одним из наиболее важных методов исследования антибиотиков. К тому же бурное развитие жидкостной хроматографии обусловлено, главным образом, интенсивной разработкой теоретических основ и практическим использованием ее высокоэффективного варианта, а также созданием и промышленным выпуском необходимых сорбентов и аппаратуры.
Сегодня ВЭЖХ представляет собой хорошо оформленный инструментальный метод, который широко применяют в самых различных областях науки и техники. Особенно велико его значение в таких важнейших областях, как биохимия, молекулярная биология, контроль загрязнений окружающей среды, а также в химической, нефтехимической, пищевой и фармацевтической промышленности.
Цель: изучить применение высокоэффективной жидкостной хроматографии в анализе антибиотиков.
Глава 1. Общая характеристика метода ВЭЖХ
1.1 Высокоэффективная жидкостная хроматография
Высокоэффективная жидкостная хроматография или жидкостная хроматография высокого давления является одним из вариантов колоночной жидкостной хроматографии[4]. Высокоэффективная жидкостная хроматография — метод разделения с использованием твердой неподвижной фазы и жидкой подвижной фазы. Разделение достигается за счет распределения, адсорбции или ионообменного процесса, в зависимости от используемого типа подвижной фазы. Высокоэффективная жидкостная хроматография имеет определенные преимущества перед газовой хроматографией. Анализируемые соединения растворяются в подходящем растворителе, и большинство разделений происходит при комнатной температуре. Таким образом, большинство нелетучих или термически нестабильных соединений, могут хроматографироваться без разложения или без необходимости получения летучих производных[26].
1.2 Состав жидкостного хроматографа
Рис.1 Блок-схема жидкостного хроматографа: 1 — резервуар для подвижной фазы; 2 — насос; 3 — инжектор; 4 — колонка; 5 — термостат; 6 — детектор; 7 — регистрирующая система.
Жидкостный хроматограф состоит из резервуара, содержащего подвижную фазу, насоса для пропускания подвижной фазы через систему под высоким давлением, инжектора для введения образца в подвижную фазу, хроматографические колонки, детектора и устройства для сбора данных (например, компьютера, интегратора или самописца). Кроме того дополнительно могут использовать компьютеры для контроля хроматографических настроек и операций, обеспечивая тем самым длительные периоды автоматической работы[6].
1.3 Насосные системы и инжекторы
антибиотик жидкостная хроматография рулид
Насосные системы высокоэффективной жидкостной хроматографии используют для дозированной подачи подвижной фазы из резервуаров с растворителем в колонку через трубки и соединения с высоким давлением. Рабочее давления составляют обычно до 1500 psi (350 кг/выше, скорость до 10 мл/мин. Насосы, используемые для количественного анализа, должны быть изготовлены из материалов, устойчивых к компонентам подвижной фазы, и обладать способностью подачи подвижной фазы с постоянной скоростью и минимальным отклонениями в течение длительного периода времени.
После растворения в подвижной фазе хроматографируемые соединения вводят в подвижную фазу, вручную шприцем или петлевым дозатором, или автоматически при помощи автодозатора. Автодозатор состоит из штатива для помещения образцов, верхние части которых имеют прокалываемую прокладку или пробку и устройства ввода для переноса образца из флаконов в петлю, откуда образец загружается в хроматограф. Для некоторых автодозаторов можно программировать контроль объема образца, число введений и циклов промывания петли, интервал между введениями и прочие рабочие параметры.
Шприц может использоваться для введения образцов вручную через прокладку, если давление на входе колонки менее 70 атм( около 1000 psi). При более высоких давлениях необходим пробоотборный клапан. Некоторые клапанные системы включают калиброванную петлю, заполняемую испытуемым раствором для переноса на колонку в подвижной фазе. В других системах, испытуемый раствор переносится шприцем в полость, а затем перенаправляется в подвижную фазу[26].
1.4 Хроматографические колонки
Хроматографические колонки представляют собой снабженные торцевыми соединениями трубки, заполненные тонкозернистыми упаковочным материалом (насадкой). Большинство колонок изготавливают из нержавеющей стали марки 316- стального сплава, который соответствует стандарту США. Этот сплав обладает отличительной устойчивостью к коррозии. Все металлические детали хроматографической системы, контактирующие с жидкостью, должны быть сделаны из этого сплава. Качество обработки внутренних стенок должна отвечать определенным требованиям. Например, степень шероховатости стенок должна быть меньше одной десятой среднего размера частиц материала, заполняющего колонку (шероховатость должна быть меньше 0,5 мкм, если колонка заполнена носителем с размером частиц 5мкм). Чтобы уменьшить шероховатость трубок, их футеруют стеклом или полимерами. В последнее время используют стеклянные трубки, которые имеют очень высокое качество поверхности трубок. Некоторые фирмы (Waters) используют для изготовления радиально сжимаемых колонок полиэтиленовые трубки. Эти колонки помещают в рубашку, в которой на них подается внешнее давление, что вызывает радиальное сжатие колонок, улучшающее их разрешающую способность и повышающее стабильность[2]. В зависимости от области применения используют колонки с различными диаметрами внутренних стенок, например для аналитического разделения используют колонки с внутренним диаметром от 2 до 5 мм, а колонки большого диаметра используются для препаративной хроматографии.
В фармацевтическом анализе разделение достигается распределением соединений испытуемого раствора между подвижной и неподвижной фазами.В зависимости от полярности неподвижной и подвижной фаз различают нормальнофазовую и обращенно-фазовую хроматографию. В нормальнофазовой хроматографии используют полярный адсорбент и неполярные подвижные фазы, в обращенно-фазовой — неполярный адсорбент и полярные подвижные фазы[16]. Распределительная хроматография почти всегда используется для растворимых углеводородных соединений с молекулярной массой менее 1000. Сродство соединений к неподвижной фазе и его время удерживания на колонке контролируется изменением полярности фаз. Полярность подвижной фазы может изменяться добавлением второго, а иногда и третьего компонента.
Неподвижные фазы для современной обращенно-фазовой жидкостный хроматографии обычно состоит из органической фазы, химически связанной с кремнеземом или иным материалом. Частицы обычно имеют диаметр от 3 до 10 мкм, но размер может изменяться до 50 мкм или более для препаративных колонок. Небольшие частицы, покрытые тонким слоем органической фазы, обеспечивают малое сопротивление массопереносу, а следовательно, быстрому переносу соединений между неподвижной и подвижной фазами. Полярность колонки зависит от полярности функциональных групп. Жидкие, не связанные неподвижные фазы не должны смешиваться с подвижной фазой. Тем не менее обычно необходимо предварительно насытить подвижную фазу неподвижной фазой для предотвращения выдавливания неподвижной фазы из колонки. Полимерные стационарные фазы, покрывающие носитель, более износостойкие.
Ионообменная хроматография используется для разделения водорастворимых ионизируемых соединений с молекулярной массой менее 1500. Неподвижные фазы — это обычно синтетические смолы. Катионобменные смолы содержат отрицательно заряженные активные участки и используются для разделения основных веществ, таких как амины, в то время как анионообменные смолы имеют положительно заряженные активные участки для разделения соединений с отрицательно заряженными группами, такими как фосфат, сульфонат или карбоксильная группа. Водорастворимые ионные или ионизируемые соединения притягиваются смолами, а разница в сродстве обуславливает хроматографическое разделение. Значение рH подвижной фазы, температура, тип иона, ионная концентрация и органические модификаторы влияют на равновесие. Для получения желаемой степени разделения данные параметры можно корректировать.
В эсклюзионной хроматографии колонки набиваются пористой неподвижной фазой. Молекулы хроматографируемых соединений фильтруются в соответствии с размером. Молекулы, которые слишком большие для проникновения в поры, проходят через колонку без задержки. Меньшие молекулы попадают в поры и удерживаются тем дольше, чем меньше размер молекул. Эти колонки обычно используют для измерения агрегации и разложения больших молекул.
1.5 Детекторы и устройства для сбора данных
Многие фармакопейные методики высокоэффективной жидкостной хроматографии требуют использования спектрофотометрических детекторов. Такой детектор состоит из проточной кюветы, закрепленной на конце колонки. Пучок ультрафиолетового света проходит через кювету и попадает на детектор. По мере элюирования соединений из колонки они проходят через кювету и поглощают излучение, приводя к измеряемому изменению уровню энергии.
Широко доступны детекторы с фиксированной, переменной и множественной длиной волны. Детекторы с фиксированной длиной волны работают при одиночной длине волны, обычно 254 нм, испускаемой ртутной лампой низкого давления. Детекторы с переменной длиной волны содержат непрерывный источник, такой как дейтериевая или ксеноновая лампа высокого давления, и монохроматор или интерференционный фильтр для получения монохроматического излучения с длиной волны, выбранной оператором. Точность длины волны детектора с переменной длиной волны, оснащенного монохроматором, необходимо проверять по рекомендованной производителем методике. Если наблюдаемые длины волн отличаются более чем на 3 нм от истинных значений, необходима перекалибровка прибора. Современные детекторы с переменной длиной волны могут программироваться на изменение длины волны по ходу анализа. Детекторы с множественными длинами волн измеряют поглощение при двух или более длинах волн одновременно. В детекторах на диодной матрице непрерывное излучение пропускается через кювету с образцом, затем разрешается на составные длины волн, которые индивидуально детектируются фотодиодной матрицей. Эти детекторы получают данные на всем интервале УФ и видимого света, обеспечивая, таким образом, аналитика хроматограммами при множественных выбираемых длинах волн и спектрами элюируемых пиков. Детекторы на диодной матрице обычно имеют меньшее отношение сигнал/ шум, чем детекторы с фиксированной или переменной длиной волны, а следовательно, менее пригодны для анализа соединений, присутствующих в низких концентрациях.
Дифференциальные рефрактометрические детекторы измеряют разность между показателем преломления чистой подвижной фазы и показателем преломления подвижной фазы, содержащей хроматографируемые соединения, по мере ее выхода из колонки. Рефрактометрические детекторы используют для детекции соединений, не поглощающих в УФ — области, но они мене чувствительны, чем УФ — детекторы. Они чувствительны к малым изменениям в составе растворителя, скорости потока и температуре, поэтому для получения удовлетворительной базовой линии может понадобиться колонка сравнения.
Флуориметрические детекторы чувствительны к соединениям, которые по своей природе флуоресцируют или могут быть превращены во флуоресцирующие производные либо химической трансформацией вещества, либо соединением с флуоресцентными реактивами по специфическим функциональным группам. Если необходима дериватизация, то ее можно провести непосредственно перед хроматографическим разделением или реактив можно ввести в подвижную фазу непосредственно перед его попаданием в детектор.
Потенциометрический вольтаметрический или полярографический электрохимические электроды используют для количественного определения веществ, которые могут окисляться или восстанавливаться на рабочем электроде. Эти детекторы селективны, чувствительны и надежны, но необходимо применение подвижной фазы, не содержащей растворенного кислорода и восстанавливаемых ионов металлов. Должен использоваться непульсирующий насос и необходимо следить за обеспечением постоянства значения рH, ионной силы и температуры подвижной фазы. Рабочие электроды чувствительны к загрязнению продуктами реакции с соответственно изменяющимся откликом.
Электрохимические детекторы с угольными пастовыми электродами могут успешно применяться для измерения нанограммовых количеств легко окисляемых соединений, в особенности фенолов и кетонов.
Продолжают разрабатываться новые детекторы для преодоления недостатков используемых детекторов.
Современные станции обработки данных получают и сохраняют сигнал детектора и распечатывают хроматограммы вместе с площадями, высотами пиков, идентификацией образцов и параметрами хроматографирования. Станции обработки данных используют также для программирования жидкостного хроматографа, контролируя большинство рабочих параметров и обеспечивая длительные периоды автоматической работы.
Данные также могут собираться на простых самописцах для ручного измерения или на независимых интеграторах, возможности которых колеблются от обеспечения распечатки площадей пиков до предоставления хроматограмм с рассчитанными площадями и высотами пиков и сохраненными данными для возможного перерасчета[26].
Глава 2 . Антибиотики и их классификация
2.1 Антибиотики и их классификация
Антибиотики — это специфические продукты жизнедеятельности или их модификации, обладающие высокой физиологической активностью по отношению к определенным группам микроорганизмов (вирусов, бактериям, актиномицетам, грибам, водорослям, протозоа) или к злокачественным опухолям, избирательно задерживая их рост или полностью подавляя развитие.
Антибиотические вещества в процессе развития их продуцентов могут выделяться и накапливаться в окружающей организм среде, они могут образовываться в виде летучих продуктов или накапливаться внутри клеток организма и освобождаться от них в результате экстракции или при разрушении клеток. В соответствии с определением понятия « антибиотик » к этим веществам относятся также химические или биологические модификации молекул природных соединений антибиотиков путем замены в них тех или иных свободных группировок. В результате химической модификации молекул пенициллина, цефалоспорина, тетрациклина и некоторых других продуктов жизнедеятельности микроорганизмов, образующихся в процессе биосинтеза, получены новые соединения с более ценными свойствами.
Выражение величин биологической активности антибиотиков производят в условных единицах, содержащихся в 1 мл раствора (ед/мл) или в 1 г препарата (ед/мг)[7].
2.2 Классификация антибиотиков
Пенициллины (-лактамные антибиотики)
а) природные пенициллины: бензилпенициллин и его соли, феноксиметил-пенициллин;
б) полусинтетические пенициллины:
— пенициллиназоустойчивые с преимущественной активностью в отношении стафилококков: оксациллин, клоксациллин, флуклоксациллин;
— широкого спектра действия (аминопенициллины): ампициллин, амокси-циллин, пивампициллин;
— широкого спектра действия, особенно высокоактивные в отношении си-негнойной палочки и других грамотрицателъных бактерий (карбокси — и уреи-допенициллины): карбенициллин, тикаришин, азлоциллин, мезлоциллин, пиперациллин;
Цефалоспорины (-лактамные антибиотики)
а) первое поколение: цефалоридин, цефазолин, цефалексин и др.;
б) второе поколение: цефамандол, цефуроксим, цефаклор и др.;
в) третье поколение: цефотаксим, цефтазидим, цефтриаксон и др.;
г) четвертое поколение: цефпиром, цефепим и другие[25];
Монобактамы (-лактамные антибиотики): азтреонам;
Карбапенемы (-лактамные антибиотики): имипенем, меронем, тиенам;
а) природные — джозамицин, мидекамицин, олеандомицин, эритромицин;
б)полусинтетические — азитромицин, диритромицин, кларитромицин, рокситромицин, спирамицин;
а) первое поколение: стрептомицин, мономицин, канамицин;
б) второе поколение: гентамицин, нетилмицин, тобрамицин;
в) третье поколение: тобрамицин, сизомицин, амикацин;
г) четвертое поколение: левомицетин;
а) естественные: тетрациклин, окситетрациклин, хлортетрациклин;
б) полусинтетические: метациклин, доксициклин, миноциклин, морфоцик-лин;
Рифамицины: рифоцин, рифамид, рифампицин;
Гликопептидные антибиотики: ванкомицин, тейкопланин;
Хинолоны: налидиксовая кислота, оксолиновая кислота;
а) препараты первого — пефлоксацин, офлоксацин, ципрофлоксацин, ломефлоксацин, норфлоксацин;
б) второго поколения — ,левофлоксацин, спарфлоксацин;
в) третьего и четвертого поколения — омоксифлоксацин, гемифлоксацин, гатифлоксацин, ситафлоксацин, тровафлоксацин;
Полимиксины: полимиксин В, полимиксин Е, полимиксин М;
Полиеновые антибиотики: нистатин, леворин, амфотерицин В;
Прочие: гризеофульвин, деквалиниума хлорид, тербинафин,доксорубицин, адриамицин, даунорубицин, эпирубицин и другие[1,7].
Глава 3. Применение высокоэффективной жидкостной хроматографии в анализе антибиотиков
Высокоэффективная жидкостная хроматография является одним из самых эффективных, селективных и чувствительных методов. Из-за своих достоинств, он широко применяется в различных анализах многих лекарственных средств. Рассмотрим некоторые из них:
3.1 Применение ВЖЭХ в анализе антибиотиков группы цефалоспоринов и гликопептидов
С помощью обращено — фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) определяли антибиотики группы цефалоспоринов 1 — 3 поколений после изучения их сорбционной способности. Изучение сорбционной способности проводили в статических условиях на кремнийсодержащих сорбентах разного происхождения[27].
Характеристика исследованных антибиотиков
Фармацевтические формы: цефазолин (натриевая соль)®, цефуроксим и цефтриаксон® — были получены из аптечной сети. Им соответствуют стандартные образцы цефазолина, цефуроксима и цефтриакосна. Одна упаковка каждого из используемых лекарственных препаратов содержит 1г химически чистого антибиотика. Растворы антибиотиков готовили исходя из терапевтических доз с концентрацией 0,25-2 мг/мл.
В качестве сорбентов использовали следующие образцы:
1. природный слоистый алюмосиликат[15];
2. природный клиноптилолит[28];
3. сорбенты на основе рисовой шелухи (РШ), которые представляют
собой аморфные образцы кремнезема с разным содержанием основного
вещества, SiO2(>99,9; 96 и92%), а также — карбонизированный кремнезем,
содержащий46% SiO2 и50% С[8,9];
4. реактив — кислота кремниевая водная, SiO2?npO, соответствующая ГОСТ4214-78[5].
Жидкостной хроматограф «Shimadzu» LC-6A (Япония), с УФ-детектором; рабочие длины волн 220 и254 нм. Колонка Zorbax ODS (4,5 х15мм), подвижная фаза ацетонитрил: вода (50:50 v/v). Хроматомасс-спектрометр Agilent 1100 SerieesLC/MSD (APCI). Колонка Hyperssil ODS (4,5 х125 мм), детектор — диодная матрица, рабочие длины волн210 и254 нм, подвижная фаза ацетонитрил: вода(50:50 v/v).
После исследований обнаружено, что для концентрирования цефуроксима и цефтриаксона при их концентрации в растворе 0,5 — 1,5 мг/мл можно рекомендовать сорбенты, полученные на основе рисовой шелухи: аморфный кремнезем с содержаниемSiO2 не ниже 99,9% и карбонизированный кремнезем(SiO246,5%). Для концентрирования цефазолина следует использовать кремневую кислоту, соответствующую по характеристике[5], либо карбонизированный кремнезем.
3.2 Применение ВЭЖХ в анализе антибиотиков группы хинолонов и фторхинолонов
Для определения фторхинолонов наиболее часто используют метод обращено — фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) с УФ-детектором при л=235 нм[31] и л=279-295 нм[32], который предложен для определения четырех и более фторхинолонов в диапазоне 4.0 — 24.0 мг/кг на колонках PhenomeneхODS C18[31,33] и LiChrosper RP-18[32]. Понизить предел обнаружения и расширить диапазон определяемых концентраций можно при использовании флуориметрического детектора, поскольку многие фторхинолоны обладают флуоресцентными свойствами.
Флуориметрическое детектирование с пределом обнаружения 5 мкг/мл применяли при определении ципрофлоксацина в плазме крови[34], свиных и лососевых мышцах[35] при л возб=278-280 нм. В качестве подвижной фазы используют смесь ацетонитрил — фосфатный буфер(рН=3.0)[34,36], ацетонитрил — метанол- ацетатный буфер (рН =3.6) [37]. Необходимо отметить, что во многих методиках в целях улучшения аналитических характеристик используют токсичные растворители, такие как ацетонитрил и метанол[37].
Растворы всех основных и вспомогательных химических реактивов готовили на бидистиллированной воде.
Антибиотики фторхинолонового ряда — ципрофлоксацин, налидиксовая кислота, флюмеквин («Sigma»), а также тетрациклин и окситетрациклин («Merсk»), содержали не менее 98% основного вещества. Рабочие растворы концентрации 0.25 мг/мл готовили растворением точной навески антибиотиков. Использовали водные растворы катионных (бромид цетилтриметиламмония и хлорид цетилпиридиния, фирмы «Мerсk»), анионных (додецилсульфат натрия, «AppliChem») и неионогенных ПАВ (Тритон Х-100, Тритон Х-305, Бридж35, Твин80 фирмы «Sigma»). Содержание основного вещества во всех препаратах ПАВ не менее99%. б- , в-, г- циклодекстрины фирмы «Fluka», содержание основного вещества не менее 98%. Для приготовления подвижной фазы использовали ацетонитрил хроматографической чистоты, фирмы «Panteac», 99,9 % основного вещества. Ацетатно-аммиачные буферные растворы готовили из 2М и .
Хроматограммы регистрировали на жидкостном хроматографе «Стайер» фирмы «Аквилон» с флуориметрическим детектором. Антибиотики разделяли на ОФ колонке Phenomenex Luna 5u C18(150Ч4.60 мм, 5мкм), снабженной предколонкой с защитным картриджем Phenomenex C18, 5мкм при температуре в изократическом режиме. Для записи и обработки хроматограмм использовали программу «Мультихром-2.4». Детектирующее устройство: источник возбуждения- кварцевая галогеновая лампа с дихроическим рефлектором, фотоэлектронный умножитель, диапазон длин волн 200-600 нм.
При изучение влияния природы и концентрации ПАВ, а также циклодекстринов на разделение и чувствительность определения флюмеквина и ципрофлоксацина в смеси с другими антибиотиками выяснили, что среди исследованных ПАВ различных классов наилучшее разделение и определение флюмеквина и ципрофлоксацина достигается в подвижной фазе, содержащей неионогенный ПАВ Тритон Х-100, который способствует увеличению площади хроматографического пика фторхинолонов в 1,9 раз, а образование комплексов включения фторхинолонов с г-циклодекстрином увеличивает площадь хроматографического пика флюмеквина и ципрофлоксацина в 2,3 и1,5 раза и пределы обнаружения уменьшает в 4,2 и 9 раз, соответственно[23].
Показано, что при анализе спарфлоксацина и моксифлоксацина методом ВЭЖХ, добавление в подвижную фазу ионпарного реагента существенно повышает эффективность колонки и симметричность пиков анализируемых соединений. Установлено, что в условиях обращеннофазовой ВЭЖХ оптимальные значения хроматографических параметров наблюдаются в подвижной фазе ацетонитрил вода при температуре колонки 40 Разработанные методики могут быть использованы при анализе субстанций и лекарственных препаратов спарфлоксацина и моксифлоксацина по разделам нормативной документации « подлинность» и « количественное определение»[14].
3.3 Применение ВЭЖХ в анализе противоопухолевых антибиотиков
Доксорубицин — антибиотик широкого спектра действия. Он является антибиотиком антрациклинового ряда и обладает противоопухолевым действием.
Согласно ВФС 42-1796-88, содержание доксорубицина опре-деляют микробиологическим методом диффузии в агар с ис-пользованием тест-культуры Bac.cereus var. mycoides 537 (спо-ры), который отличается большой трудоемкостью, длительно-стью и неспецифичностью. Из-за недостатков микробилогического метода, доксорубицин определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Во время экспериментальной части, принимали во внимание результаты исследования хроматографической активности доксорубицина в тонких слоях нормальнофазного (пластины «Silufol UV-254») и обращеннофазного (пластины «Silufol UV-254», обработанные вазелиновым маслом) сорбентов с применением подвижных фаз различной полярности, в качестве неподвижной фазы использова-ли обращеннофазный сорбент «Новопак Т-18», а в качестве элюента — систему растворителей изопропанол-ацетатный буфер (рН=4,5) в соотношении 3:7 (по объ-ему). Определения проводили на хроматографе «Water Alian» (USA) с детектором фотодиодной матрицы на колонке размером 150×3,9 мм. Скорость подачи элюента составляла 0,7 мл/мин при температуре колонки 37°С.
На основании результатов методик определения получили, что разработанный вариант определений доксорубицина по методу ВЭЖХ, в отличие от фармакопейной (микробиологический метод диффузии в агар), характеризуется более высокой чувствительностью, селективностью и воспроизводимостью. Относительная ошибка среднего результата (n=5;P=0,95) при определении исследуемого вещества в субстанции и лекарственных формах по предлагаемой методике в 2-2,5 раза ниже, чем при использовании фармакопейной методики. Разработанная методика упрощает процесс анализа, сокращая в 35 раз его продолжительность (с 18 ч до 30 мин) и позволяет проводить определение Доксорубицина в присутствии других компонентов лекарственных форм[3]
Также высокоэффективную жидкостную хроматографию использовали для определения противоопухолевого препарата митомицина С (ММС) в образцах ткани мочевого пузыря методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии со спектрофотометрическим (365 нм) и масс-спектрометрическим детектированием с пределами обнаружения (отношение сигнал/шум = 3) 50 и 10 нг/мл соответственно. Образцы ткани гомогенизировали и проводили процедуру твердофазной экстракции на патроне DSC-18. Методика применена для сравнения эффективности проникновения ММС в ткань мочевого пузыря за счет пассивной диффузии и внутриполостного лекарственного электрофореза. Внутриполостной лекарственный электрофорез повышает степень проникновения митомицина в стенки мочевого пузыря в 3-5 раз по сравнению с пассивной диффузией[17].
3.4 Применение ВЭЖХ в анализе антибиотиков группы пенициллина
Бициллин-3 является пенициллином пролонгированного действия и представляет собой смесь натриевой, новокаиновой и бензатиновой солей бензилпенициллина. По действую-щей ВФС 42-3034—98 определение бензилпенициллина в препарате проводят с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, новокаин определяют спектрофотометрически, а бензатин экстрагируют эфиром из водного раствора, насыщенного хлоридом натрия. После выпаривания эфира бензатин определя-ют титрованием хлорной кислотой. В Европейской Фармакопее содержа-ние бензилпенициллина и бензатина в бензатиновой соли бензилпенициллина определяют с помощью градиентной высокоэффективной жидкостной хроматографии в сме-си метанола с раствором фосфата натрия при рН 3,5.
Использовали бициллин-3 производства АКО «Синтез» (Кур-ган).
Исследование проводили на хроматографе фирмы «Waters» (США) с насосом модели 510, УФ-детектором модели 481 и ин-жектором модели 7125 (Rheodyne) с дозирующей петлей вмести-мостью 50 мкл. Для детектирования использовали длину волны 214 нм, при которой хорошо детектируются все анализируемые соединения. Регистрацию хроматограмм и расчет площадей пи-ков и основных параметров удерживания проводили с помощью персонального компьютера с аналого-цифровым преобразова-телем и программой «Мультихром».
Был изучен обращенно-фазный вариант метода ВЭЖХ на колонке «Luna С18(2)» раз-мером 250 х 4,6 мм фирмы «Phenomenex» (США), поскольку колонка зарекомендова-ла себя ранее как относительно дешевая с улучшенной симметрией выхода пиков органических аминов. С этой же целью в ка-честве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрила с буферным раствором, со-держащим в качестве одного из компонен-тов триэтиламин, имеющим рН= 5,0[18].
Также с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии был изложен комплексный подход к конструированию высокоэффективной технологии получения полусинтетических антибиотиков, включающей не только стадию ферментативного синтеза, но и стадии разделения компонентов реакционной смеси.
В работе использовали образцы антибиотиков — ампициллина, амоксициллина, цефалексина, цефадроксила и цефаклора, ацилирующие агенты — метиловый эфир Д- фенилглицина и метиловый эфир п — гидрокси — Д- фенилглицина.
В качестве биокатализатора использовали иммобилизованную аминоцефалоспоринсинтетазу их Xanthomonas rubrilineans, штамм ВКМ-629[24], полученную так, как это описано в работе[11,12].
Применяли хроматограф фирмы « Waters Associates Inc.» (США) с УФ- детектором с переменной длинной волны и колонкой из нержавеющей стали, заполненной носителем « Sylasorb C18» с размером частиц 4,5 мкм. Скорость подачи подвижной фазы 1 мл/мин.
В качестве подвижной фазы использовали смеси метанола с фосфатно-аммиачным буфером 0,05М, pH 2,05 в различных соотношениях[13].
3.5 Использование ВЭЖХ в анализе антибиотиков группы гликопептидов и рифамицинов
С помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии проводили качественный и количественный анализ ряда антибиотиков-гликопептидов и грамицидина S на отечественном жидкостном микроколоночном хроматографе Милихром А-02. Кроме того можно также проводить химическую идентификацию антибиотиков в неочищенных образцах, что важно для лабораторий, ведущих скрининг природных или полусинтетических антибиотиков[30].
При изучения условия десорбции антибиотиков группы гликопептидов, такие как: эремомицин, ванкомицин, ристомицин А и тейкопланин А2 определили, что они могут быть элюированы с ультрадисперсного углеродного сорбента при исполь-зовании органических растворителей (ТГФ, т-БС, ИП, ДМСО) в смеси с 0,5 М уксус-ной кислотой. Оптимальный растворитель и его концентрацию, обеспечивающую наиболее эффективную элюцию, подбирали индивидуально для каждого антибиотика. Показано, что для ристомицина А, ванкомицина и эремомицина наиболее эффектив-на элюирующая смесь, содержащая т-БС, а для тейкопланина А2 — TГФ. После де-сорбции физико-химические (молекулярная масса, УФ спектры, время удерживания при ВЭЖХ) и антимикробные свойства антибиотиков оставались неизменными[10].
При изучении антибиотиков группы рифамицины были получены продукты деструкции и окисления рифампицина, которые охарактеризованы методом ВЭЖХ и идентифицированы методом масс-спектрометрии. Изучена стабильность рифампицина в водной фазе и в составе липосом при 4 и 25 °C. Показано, что при хранении основным продуктом деструкции в липосомах является 3-формилрифамицин SV. Установлено, что антибактериальная активность антибиотика в составе липосом не отличается от его активности в водной фазе и не изменяется при хранении[22].
3.6 Анализ препарата Рулид и Азитромицина с помощью ВЭЖХ
Для анализа двух препаратов были разработаны методики определения:
— разрабатывали методику определения антибиотика Рокситромицина в сыворотке крови методов ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием с использованием Кларитромицина в качестве внутреннего стандарта. Методику использовали для исследования фармакокинетики лекарственного препарата “Рулид”. Рокситромицин и Кларитромицин из образцов сыворотки извлекали методом твердофазной экстракции на патроне с полярным сорбентом — цианопропилсилилсиликагелем. Абсолютная степень извлечения составила 89.6 и 92.5%, соответственно. Хроматографическое разделение проводили на колонке Nucleodur C18 Isis с подвижной фазой вода-метанол- ацетонитрил-муравьиная кислота (499 : 250 : 250 : 1 по объему). Регистрировали в режиме мониторинга отдельных ионов с m/z 837.7 Рокситромицина и m/z 748.7 Кларитромицина соответственно[19].
— разрабатывали метод количественного определения азитромицина ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием. Предел обнаружения препарата составляет 0,5 нг/мл. Метод был применен для изучения фармакокинетики и биоэквивалентности препарата Азитромицин (капсулы по 250 мг отечественного производства) в сравнении с препаратом Сумамед® (аналогичная лекарственная форма производства компании «Плива», Хорватия). Фармакокинетическое исследование проводилось открытым перекрестным рандомизированным методом. В исследование были включены 18 добровольцев. Были рассчитаны фармакокинетические параметры, необходимые для оценки биоэквивалентности изучаемого препарата. Статистический анализ параметров фармакокинетики показал биоэквивалентность препаратов Азитромицин и Сумамед[20].
3.7 Определение концентрации антибактериальных глазных капель
С помощью метода ВЭЖХ-МС/МС определяли концентрацию антибактериальных глазных капель Сигницеф, Офтаквикс и Вигамокс в содержимом влаги передней камеры глаза (ВПКГ). В исследование включены 90 пациентов, которые были распределены на три группы по 30 человек. Пациентам первой группы закапывали 0,5% раствор моксифлоксацина (Вигамокс), пациентам второй и третьей группы 0,5% раствор левофлоксацина, соответственно, Офтаквикс и Сигницеф. Пациентам всех трех групп антибактериальные капли закапывали за один час до начала факоэмульсификации, четырехкратно по 1 капле с интервалом 15 минут. В результате, средняя концентрация глазных капель Офтаквикс и Вигамокс во ВПКГ была одинаковой и составляла, соответственно, €к 0,9 мкг/мл и 1,0 мкг/мл. В группе пациентов, которым в качестве профилактики послеоперационных осложнений назначали Сигницеф, средняя концентрация препарата равнялась -1,5 мкг/мл. Средняя концентрация всех исследуемых препаратов, которые принадлежат к фторхинолонам III-IV поколения, была в несколько раз выше, чем средняя МПК90 для выделенных от пациентов штаммов, что должно способствовать безопасному течению послеоперационного периода и профилактике инфекционных осложнений[21].
Метод ВЭЖХ имеет широкую область применения. С помощью него проводят качественный и количественный анализ антибиотиков различных групп, разрабатывают новые методики определения. Кроме того методом высокоэффективной жидкостной хроматографии был изложен комплексный подход к конструированию высокоэффективной технологии получения полусинтетических антибиотиков, а также проводили анализы с полученными продуктами декструкции и окисления антибиотиков.
Высокоэффективная жидкостная хроматография кроме медицины используется и в пищевой промышленности, там определяют остаточное количество антибиотиков, например тетрациклина и левомицетина в сыром и пастеризованном молоке.
Антибактериальные лекарственные средства. Методы стандартизации препаратов.М.: ОАО « Издательство Медицина», 2004. 944с.
Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии: Пер. с англ. / Бауер Г., Энгельгард Х., Хеншен А. и др.; Под ред. А. Хеншен и др. М.: Мир, 1988.- 688с.
Высокоэффективная жидкостная хроматография в анализе доксорубицина / В. К. Шарманов, Е.Н. Карпенко, Л.Е. Сипливая и др. // Журнал Фармация.2004.№3.С.810.
Государственная Фармакопея СССР: Вып. 1. Общие методы анализа / МЗ СССР. — 11-е изд., доп. М.: Медицина, 1987.336с.
ГОСТ4214-78. Реактивы. Кислота кремневая водная. Технические условия.
Грушка, Э. Количественный анализ хроматографическими методами. / Грушка Э., Йенсен Э., Хатиб С., Левин С. и др.; Под ред. Кэц: Пер. с англ. М.: Мир, 1990.320с.
Егоров, Н.С. Основные учения об антибиотиках: Учеб. для студентов биолог. спец. ун-тов. 4-е изд., перераб. и доп.М.: Высш. шк., 1986448с.
Земнухова, Л.А., Федорищева, Г.А., Егоров, А.Г., Сергиенко, В.И. // Журнал прикладной химии. 2005. Т. 78, № 2.С. 324 — 328.
Земнухова, Л.А., Егоров, А.Г., Федорищева, Г.А., Баринов, Н.Н., Сокольницкая, Т.А., Боцул, А.И. // Неорганические материалы. 2006. Т. 42, №1. С. 27 — 32.
Изучение сорбции антибиотиков — гликопептидов на ультрадисперсном углеродном сорбенте /А. В. Тимофеева, В.Н. Буравцев
и др. // Журнал Биотехнология.2010.№ 2.С. 7080.
Курочкина В. Б., Ныс П. С., Антибиотики и химиотерапия, 44(5), 12 — 16 (1999).
Курочкина В. Б. , Ныс П. С. , Антибиотики и химиотерапия, 44(8), 6 -11 (1999).
Курочкина, В. Б. Ферментативный синтез аминобеталактамов. Физико- химические основы процессов разделения компонентов реакционных смесей / В. Б. Курочкина, П. С. Ныс // Химико- фармацевтический журнал.2003.Т. 35, № 12.С.3037.
Коновалов, А.А. ,Дорофеев, В.Л., Арзамасцев, А. П. / Фармацевтический анализ лекарственных средств группы фторхинолонов с использованием метода ВЭЖХ // Вестник. Серия: Химия. Биология. Фармация.2004.№2.С.216-221.
Машкова, С.А., Разов, В.И., Тонких, И.В., Жамская, Н.Н. и др. // Химия и химическая технология. 2005. Т. 48, Вып. 6. С. 149-152.
Основы аналитической химии. В 2 т. Т. 1: учеб. Для студ. Учреждений высш. Проф. Образования / Т.А. Большова, Г.Д. Брыкина, С.Г. Дмитриенко и др.; Под ред. Ю. А. Золотова. 5-е изд., стер.- М.: Издательский центр « Академия», 2012.384с.
Определение митомицина С в тканях мочевого пузыря методом обращеннофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии /
А. А. Сидорова, Л. А. Карцова, А. В. Григорьев, В. В. Протощак, Е. А. Мурашко // Журнал аналитической химии. 2010.Т. 65, № 8. С. 856860.
Определение компонентов препарата « Бициллин 3» методом высокоэффективной жидкостной хроматографией / М. А. Казьмин, А. В. Михалев, А. П. Арзамасцев // Журнал Фармация. 2002.№3.С.911.
Определение рокситромицина в сыворотке крови методом жидкостной хроматографии с масс спектрометрическим детектированием / И. В. Семак, А. Н. Алексеев и др. // Журнал аналитической химии.2011.Т. 66, № 2.С. 199205.
Определение азитромицина в плазме крови методом ВЭЖХ с масс спектрометрическим детектированием / В. В. Писарев, Л. Б. Смирнова, Н. Е. Москалева и др. // Журнал Клин.фармакокинетика.2004.№1.С. 2326.
Определение концентрации глазных капель левофлоксацина и моксифлоксацина в содержимом влаги передней камеры глаза методом ВЭЖХ МС / И. Н. Околов, Ю. В. Тахтаев, А. И. Мяжитова и др. // Журнал Катарактальная и рефракционная хирургия.2012.Т. 12, № 4.С. 4451.
Продукты деструкции и бактериостатическая активность рифампицина в водном растворе и в составе липосом / Г. М. Сорокоумова, В. В. Востриков, А. А. Селищева и др. // Химико-фармацевтический журнал.2008.Т. 42, № 8.С. 35 38.
Смирнова,Т.Д. Обращено-фазовая ВЭЖХ флюмеквина и ципрофлоксацина в организованных средах / Т. Д. Смирнова,С. Н. Штыков, Н. В. Неврюева // Сорбционные и хроматографические процессы. 2010. Т. 10, Вып. 1.С. 142 149.
Уваров, Н. Н.,Крестьянова, И. Н., Дмитриева С. Д. , Антибиотики и химиотерапия, 37(4), 16-19 (1992).
Фармакология / Под ред. Проф. Р.Н. Аляутдина.4-е изд.; перераб. и доп.М.: ГЭОТАР — Медиа, 2008. 832с.
Фармакопея США: USP 29; Национальный формуляр : NF 24 : в 2 т. : [ пер. с англ.].М.: ГЭОТАРМедиа, 2009.Т.2 С. 25042511.
Чучалина, И.В. Концентрирование цефалоспориновых антибиотиков на природных сорбентах // электронный научный журнал «Исследовано в России».2006 С.1842-1851[Электронный ресурс]. URL: http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2006/196.pdf .
Шапкин, Н. П, Поляков, В.Ю., Шапкина, В.Я, Сибирцев, Ю.Т. и др. // Химия и химическая технология. 2002. Т. 45, вып. 2. С. 101-106.
Штыков С.Н. Химический анализ в нанореакторах. Основные понятия и применение // Журн. аналит. химии. 2002. Т.57, №10. С.1018-1028.
Экспрессанализ антибиотиков пептидной группы на микроколоночном хроматографе Милихром А 02 / А. В. Тимофеева, М. В. Серебрякова, Л. А. Баратова, Г. С. Катруха // Журнал Биотехнология.2009.№ 1.С.90 95.
Shervington L. A., Abba M., Hussain B. and Donnelly J. The simultaneous separation and determination of five quinolone antibotics using isocratic reversed-phase HPLC: Application to stability studies on an ofloxacin tablet formulation // J. Pharm. Biomed. Anal. 2005. V. 39. №3-4. P.769-775.
Inкs M., Santoro R.M., Kassab N. M., Singh A.l K., Kedor-Hackmam E. M. Quantitative determination of gatifloxacin, levofloxacin, lomefloxacin and pefloxacin fluoroquinolonic antibiotics in pharmaceutical preparations by high-performance liquid chromatography // J. Pharm. Biomed. Anal. 2006. V. 40. №1. P.179-184.
Mancean S., Giequel M., Lanrentie M. Simultaneous determination of enrofloxacin and ciprofloxacin in animal biomedical fluidsby high-performance liquid chromatography. Application in pharmacokinetic studies in pig and rabbit // J. Chromatogr. B: Biomed. Sci. Appl. 1999. V.726. №1-2. P.175-178.
Imre S., Dogaru M.T., Vari C.E., MunteanT., Kelemen L. Validation of an HPLC method for the determination of ciprofloxacin inhuman plasma // J. Pharm. Biomed. Anal. 2003. V. 33. №1. P.125-130.
Ramos M., Aranda A., Garcia E., Reuvers T., Hooghuis H. Simple and senstive determination of five quinolones in food by liquid chromatography with fluorescence detection // J. Chromatogr. B. 2003. V. 789. №2. P.373-381.
Zotou A., Miltiadou N. Sensitive LCdetermination of ciprofloxacin in pharmaceutical preparations and biological fluidswith fluorescence detection // J. Pharm. Biomed. Anal. 2002.V. 28. №3-4. P.559-568.
El-Kemary M., Dauhal A. Photochemistry and photophysics of cyclodeхtrin caged drugs: relevance to their stability and efficiency // Cyclodeхtrin materials in photochemictry, photoph. Ed. by Douhal A. — Elsevier. 2006. V.1. P.79-105.
Хроматографический анализ как критерий однородности вещества. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), определение с ее помощью компонентов препарата «Бициллин-3». ВЭЖХ в анализе препаратов с пропифеназоном. Стандартизация препарата «Аданол».
реферат [746,0 K], добавлен 27.11.2013
Первооткрыватели антибиотиков. Распространение антибиотиков в природе. Роль антибиотиков в естественных микробиоценозах. Действие бактериостатических антибиотиков. Устойчивость бактерий к антибиотикам. Физические свойства антибиотиков, их классификация.
презентация [3,0 M], добавлен 18.03.2012
Общая характеристика антибиотиков и особенности их получения. Схема производства пенициллина. Использование рДНК-биотехнологии. Применение антибиотиков в пищевой промышленности и сельском хозяйстве. Классификация антибиотиков по штаммам-продуцентам.
презентация [488,1 K], добавлен 04.12.2015
Характеристика хроматографических методов идентификации антибиотиков и их отнесения к той или иной группе антибактериальных препаратов. Анализ исследований ученых мира в сфере выявления и классификации антибиотиков в различных медицинских препаратов.
курсовая работа [29,6 K], добавлен 20.03.2010
Оптимизация фармакодинамики антибактериальных препаратов. Фармакокинетика полусинтетических пенициллинов, цефалоспоринов III и IV поколения, аминогликозидных антибиотиков. Определение антибиотиков в сыворотке крови и смешанной нестимулированной слюне.
курсовая работа [421,4 K], добавлен 28.01.2011
История открытия антибиотиков. Механизм действия антибиотиков. Избирательное действие антибиотиков. Резистентность по отношению к антибиотикам. Основные группы известных на сегодняшний день антибиотиков. Основные побочные реакции на прием антибиотиков.
доклад [30,0 K], добавлен 03.11.2009
Особенности использования антибактериальных средств для лечения и профилактики инфекционных заболеваний, вызванных бактериями. Классификация антибиотиков по спектру противомикробного действия. Описания отрицательных последствий применения антибиотиков.
презентация [5,6 M], добавлен 24.02.2013
Механизм действия антибиотиков на микробную клетку, направления и этапы исследования данной тематики, современные достижения. Влияние антибиотиков на макроорганизм. Антибиотикорезистентность и пути ее преодоления. Возможные осложнения при их применении.
реферат [34,4 K], добавлен 25.08.2013
Классификация и характеристика феназинов. Применение феназиновых антибиотиков и их продуцентов. Пути биосинтеза феназиновых антибиотиков. Выделение феназина из культуральной жидкости. Подбор оптимальных условий хранения феназиновых антибиотиков.
курсовая работа [790,8 K], добавлен 18.05.2013
Химическое строение и физико-химические свойства пенициллинов; реакции подлинности. Образование пенилловой и пенициленовой кислот, их использование в анализе. Цефалоспорины, аминогликозиды; испытания на чистоту; фармакокинетика, побочные действия.
курсовая работа [2,6 M], добавлен 18.05.2011
источник